Rinascita e crescita dei batteri lattici

Abstract

Fonte: Ayivi, R. et al., La coltivazione, la crescita e la vitalità dei batteri dell'acido lattico: una prospettiva di controllo della qualità. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra il metodo per recuperare i batteri lattici stressati da freddo da uno stock di glicerolo congelato, ripristinare la vitalità batterica attraverso l'incubazione anaerobica e isolare le colonie attive per l'espansione della coltura.

Protocollo

1. Protocollo per l'attivazione e il controllo di qualità delle colture di batteri lattici (LAB)

1. Prelevare la riserva di glicerolo preparata dei ceppi LAB (in provette da centrifuga da 2 mL) dal congelatore a bassissimo temperatura a -80 °C e non lasciarla scongelare prima dell'uso.
2. Pulire e disinfettare l'apertura delle provette da centrifuga con alcool al 70% e agitare delicatamente prima dell'uso.
3. Pipettare circa 250 μl (0,25 mL) della coltura stock LAB dalle provette da centrifuga in provette MRS (deMan, Rogosa e Sharpe multimedia) fresche da 2 mL.
4. Agitare delicatamente, parafilmare le provette e incubarle anaerobicamente per una notte a 42 °C per 12-16 ore.
5. Prelevare circa 500 μL (0,5 mL) delle colture coltivate durante la notte dalle provette MRS da 2 mL in provette MRS fresche da 7 mL, vorticare e incubarle anaerobicamente durante la notte a 42 °C per 12-16 ore.
6. Valutare la crescita microbica misurando la densità ottica (OD) o la crescita delle colture a 610 nm con uno spettrofotometro UV-visibile e registrando risultati accettabili tra 0,7 e 0,9.
7. Striare le colture notturne dalle provette MRS da 7 mL su piastre di agar MRS e MRCM-PYR (clostridiale rinforzato modificato-piruvato) e incubarle anaerobicamente per 72 ore a 42 °C.
8. Le colonie isolate vengono prelevate dalle piastre di agar, trasferite in provette MRS fresche da 7 mL, delicatamente agitate e incubate anaerobicamente per una notte a 42 °C per 12-16 ore.
9. Conservare le piastre di agar contenente i ceppi isolati a 4 °C in frigorifero per una settimana.
10. Misurare e confermare l'OD (tra 0,7 e 0,9) dalle provette MRS da 7 mL delle colture LAB isolate dalle piastre striate a 610 nm e utilizzarle come colture di lavoro per tutti gli esperimenti correlati.
11. Per ottenere un rapporto 1:10, eseguire diluizioni di dieci volte (diluizioni seriali) delle colture LAB coltivate dalle provette MRS finali da 7 mL utilizzando 9 mL di acqua peptonica (un tampone fisiologico).
12. Infine, prelevare circa 250 μL (0,25 mL) da diluizioni seriali appropriate per tutti gli esperimenti di fermentazione.
13. Attivare il brodo contenente ceppi (250 μL) dal passaggio 2.12 trasferendoli in brodo MRS fresco da 7 mL e incubandoli anaerobicamente a 42 °C per 16 h.
    NOTA: Tutti i ceppi di L. bulgaricus sono stati attivati nel brodo MRS appena preparato e sono stati poi incubati anaerobicamente a 42 °C per 16 ore al fine di raggiungere una densità ottica (OD₆₁₀ nm) di crescita batterica compresa tra 0,7 e 0,9. La crescita batterica è stata misurata con uno spettrofotometro UV-visibile a 610 nm. I valori di pH delle colture notturne erano compresi tra 3,5 e 5,3 a causa della produzione di acido lattico, un prodotto finale organico della fermentazione LAB. Sono state rispettate e osservate le procedure di sicurezza, come la corretta circolazione del flusso d'aria nella cappa di biosicurezza e l'evitare ustioni durante l'uso del bruciatore Bunsen.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Blu Anilina	Termo Scientifico	Codice: R21526	25 g
Estratto di manzo	Prodotti di ricerca internazionale	50-197-7509	500 g
Estratto di lievito	Fisher Scientifico	BP1422-500	500 g
Cloruro di calcio diidrato	Fisher Scientifico	C79-500	500 g
Destrosio anidro	Fisher Scientifico	BP350500	500 g
D-fruttosio	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco agar in polvere	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY agar	Difco	211921	500 g
Provetta per microcentrifuga Eppendorf (Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientifico	05-402-12	2 ml
Glicerolo	Termo Scientifico	PI17904	500 ml
Incubatore a CO₂ a infrarossi	Forma Scientifica
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Collezione di cultura di tipo americano (ATCC)	Codice ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgaria	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratorio di Microbiologia e Biotecnologie Alimentari (NCATSU)	TACCOLA
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Laboratorio di Microbiologia e Biotecnologie Alimentari (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Laboratorio di Microbiologia e Biotecnologie Alimentari (NCATSU)	RD2
L-cisteina cloridrato monoidrato	Sigma-Aldrich	Codice C6852-25G	25 g
Maltosio monoidrato	Fisher Scientifico	Visualizzazione del materiale M75-100	100 g
Brodo MRS	Neogen	50-201-5691	5 kg
Peptone n. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Fosfato di potassio bibasico (K₂HPO₄)	Prodotti di ricerca internazionale	50-712-761	500 g
Acetato di sodio triidrato	Fisher Scientifico	S220-1	1 kg
Cloruro di sodio	Fisher Scientifico	BP358-1	1 kg
Piruvato di sodio	Fisher Scientifico	BP356-100	100 g
Provette con tappi a vite rivestiti in gomma	Fisher Scientifico	FB70125150	25 x 150 millimetri
Interpolazione 80	Fisher Scientifico	T164-500	500 ml
Congelatore ultra basso	Così basso
Uracile	ACROS Organics	AC157301000	100 g
Spettrofotometro UV-visibile	Thermo Fisher Scientifico	Evoluzione 201
Genio del vortice 2	Fisher Scientifico
Estratto di lievito	Fisher Scientifico	BP1422-500	500 g
Etanolo	Fisher Scientifico	T08204K7	4 L
Acido cloridrico (6N (certificato), Fisher Chemical)	Fisher Scientifico	SA56-500	500 ml