Precipitazione di calcite indotta microbiologicamente da Sporosarcina pasteurii

Abstract

Fonte: Bhaduri, S., et al., Precipitazione di calcite microbiologicamente indotta mediata da Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra il metodo di arricchimento di Sporosarcina pasteurii con urea e cloruro di calcio per innescare l'attività dell'ureasi, portando alla formazione di cristalli di calcite visibili attraverso la precipitazione di calcite microbiologicamente indotta, o MICP.

Protocollo

1. Protocollo per l'arricchimento dei nutrienti per accelerare le precipitazioni

1. Trasferire 9 ml del liquido di coltura preparato (cellule + terreno) in diverse provette da centrifuga sterilizzate, ciascuna del volume di 10 ml.
2. Preparare una soluzione madre da 100 ml dell'arricchimento esterno costituito da quattro componenti nelle seguenti concentrazioni in terreno fresco: urea: 2 g/l, cloruro di ammonio: 1 g/l, bicarbonato di sodio: 212 mg/l, cloruro di calcio: 280 mg/l. Misurare attentamente tutti gli ingredienti utilizzando una bilancia analitica e mescolare tutto tranne l'urea con il terreno fresco in un becher e porre in autoclave (121 °C, 15 psi, 15 min).
   1. Dopo l'autoclave, miscelare la quantità necessaria di urea (2 mg) con 1 ml di terreno fresco e passarla attraverso una siringa dotata di un filtro per siringa da 0,22 μm per completare il processo di arricchimento.
   2. Aggiungere 1 ml di questo terreno di arricchimento con additivi alle provette da centrifuga sterilizzate contenenti 9 ml del liquido di coltura preparato (cellule + terreno).
      NOTA: L'urea, essendo degradabile a temperature elevate, non può essere sterilizzata in autoclave. Quindi, dopo che gli altri componenti sono stati sterilizzati in autoclave (121 °C, 15 psi, 15 min), l'urea viene aggiunta per ultima attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm.
3. Agitare accuratamente ogni tubo utilizzando un vortice meccanico. Trasferire i liquidi arricchiti (cellule + terreno + additivi) in un incubatore non agitabile a 30 °C. Monitorare regolarmente tutte le unità per l'inizio delle precipitazioni. Utilizzando un microscopio ottico, iniziare le osservazioni microscopiche una volta rilevato l'inizio delle precipitazioni a occhio nudo. Questo di solito avviene tra le 30 e le 36 ore dopo l'inizio degli esperimenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Palloni in pyrex	Fisher Scientifico	S63268	Corning Erlenmeyer
Cilindro graduato	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Classe A Cilindro Graduato con Cal Cert,TC; 1000 mL,1/confezione
Bilancia analitica	OHAUS	AX124E	Utilizzato per misurare il peso dei reagenti
Autoclave	Brinkmann	58619000
Nastro per autoclave	VWR	52428864
Alluminio	Sigma-Aldrich	Z185140	Essere utilizzato per sigillare il pallone prima di metterlo in autoclave
Stock batterico	Cedano	11859	-80°C stock di S. pasteurii, ATCC No. è menzionato contro Cat. No.
Pipettatori meccanici monocanale Mline, volume variabile	Biohit	725010	Commercializzato da VWR con il numero di catalogo 14005976
Puntale per micropipetta	Fisher Scientifico	Codice 212772B	Utilizzato per graffiare le piastre di agar
Incubatrice	Raccoglitore	80079098	incubatore per microbiologia, serie BF
Incubatore a scuotimento	VWR	14004300	Incubatori con agitazione da banco VWR Signature
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Utilizzato per sigillare le piastre di agar
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Arricchimento per mezzo nutritivo
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S8875	Arricchimento per mezzo nutritivo
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1016	Arricchimento per mezzo nutritivo