Identificazione ad alto rendimento di polimeri repellenti ai batteri tramite screening di microarray

Abstract

Fonte: Venkateswaran, S., et al. Identificazione ad alto rendimento di polimeri repellenti ai batteri per dispositivi medici. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra un metodo ad alto rendimento per identificare polimeri repellenti ai batteri utilizzando un vetrino per microarray esposto a colture batteriche miste. Il legame batterico è valutato mediante fluorescenza DAPI, dove un segnale ridotto indica polimeri con un attacco superficiale minimo.

Protocollo

1. Inoculazione di microarray polimerici con batteri

NOTA: Garantire una buona tecnica asettica. Tutte le manipolazioni delle colture devono essere eseguite in un ambiente sterile: utilizzando un bruciatore Bunsen o in una cappa a flusso. Le colture devono essere coltivate con disponibilità di ossigeno, terreno di coltura e temperatura regolati in base alle esigenze di ciascuna specie.

1. Preparare le colture durante la notte inoculando 5 ml di brodo Luria-Bertani (LB: 10 g/L di Bacto-triptone, 5 g/L di cloruro di sodio, NaCl e 10 g/L di estratto di lievito) con una colonia da una piastra. Incubare per una notte a 37 °C, agitando a 200 giri/min (giri al minuto).
2. Preparare le scorte congelate di colture notturne con l'aggiunta di glicerolo (concentrazione complessiva del 10%) e conservare le scorte a -80 °C.
3. Al fine di determinare il numero di cellule dai campioni degli stock batterici scongelati, eseguire diluizioni seriali di ciascun stock e far crescere i batteri durante la notte su terreni solidi. La determinazione accurata del numero di cellule negli stock garantisce un'inoculazione appropriata di ciascuna specie.
4. Preparare gli inoculi per il microarray. Le colture di singole specie vengono coltivate come sopra e applicate direttamente ai microarray. BacMix-1 è una miscela batterica di Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) e Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 è una miscela batterica costituita da Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae ed Enterococcus faecalis (E. faecalis).
5. Per produrre una delle due colture miste, mescolare per una notte in volumi uguali (3 ml ciascuno) e diluire quattro volte con LB fresco (fino a circa 50 ml di volume finale).
6. Posizionare i microarray polimerici sterilizzati a raggi ultravioletti in piastre rettangolari a 4 pozzetti e incubarli con 6 ml di colture batteriche miste a 37 °C con leggera agitazione (30 giri/min) per 5 giorni.
7. Dopo l'incubazione, sciacquare delicatamente i microarray due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS: 137 mM di NaCl, 2,7 mM di cloruro di potassio, KCl, 10 mM di idrogeno fosfato disodico, Na₂HPO₄, 1,8 mM di diidrogeno fosfato di potassio, KH₂PO₄) e incubare con una soluzione di 1 μg/ml di colorante 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS per 30 minuti.
8. Lavare i vetrini colorati in una piastra a pozzetti fresca coprendo con PBS e agitando delicatamente, cambiando il PBS una volta. Asciugare sotto un flusso d'aria. Applicare un vetrino coprioggetto sul vetrino del microarray e sigillarlo in posizione con la colla. Una volta asciutta, sterilizzare la superficie esterna con etanolo al 70% (v/v).
9. Smaltire in modo sicuro le colture in base al loro livello di contenimento.

2. Imaging e analisi di microarray

1. Cattura singole immagini per ogni punto polimerico nei canali DAPI (Excitation/Emission, Ex/Em = 358 nm / 361 nm). Eseguire questa operazione manualmente con un microscopio a fluorescenza o utilizzando un microscopio a fluorescenza automatizzato (con un tavolino X-Y-Z controllato da un software di acquisizione immagini) dotato di un obiettivo 20X.
   NOTA: Regolare il microscopio per ottenere immagini utilizzando il campo chiaro e i canali DAPI. Assicurarsi che il guadagno e il tempo di esposizione per l'acquisizione delle immagini per tutti i microarray siano gli stessi.
2. Ottieni l'intensità media della fluorescenza di ogni punto nel canale DAPI scegliendo l'area dello spot e quantificando la fluorescenza con un software di elaborazione delle immagini.
3. Per la fluorescenza di fondo di ogni spot, ottenere immagini degli spot polimerici su un microarray replicato incubato solo con terreni privi di batteri. Dedurre la fluorescenza di fondo dall'intensità della macchia per ottenere la fluorescenza dai batteri.
4. Calcola il valore medio normalizzato dai quattro punti, che rappresentano ciascun polimero, utilizzati per confrontare il legame batterico di vari polimeri.
5. Identificare i polimeri che presentano il minor legame batterico (fluorescenza più bassa) come polimeri "colpiti".

Materiali