Preparazione dell'inoculo di Escherichia coli enteroemorragico bioluminescente

Abstract

Fonte: Kuo, C., et al. Rilevamento della colonizzazione enteroemorragica di Escherichia coli nell'ospite murino mediante sistema di bioluminescenza in vivo non invasivo. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra la preparazione di una sospensione enteroemorragica di Escherichia coli che esprime luciferasi da stock congelato per l'uso come inoculo orale in modelli animali. Ciò consente il monitoraggio bioluminescente in tempo reale della colonizzazione intestinale durante gli studi di infezione in vivo.

Protocollo

1. Preparato di batteri bioluminescenti EHEC ( Escherichia coli enteroemorragico) per l'inoculazione orale

NOTA: Il diagramma di flusso della sequenza temporale delle procedure sperimentali per la preparazione EHEC e la sonda sonda orale nel topo è presentato nella Figura 1 per facilitare la preparazione sperimentale.

1. Stria dei batteri E. coli O157:H7 EDL933 che ospitano il plasmide luciferasi su una piastra di agar LB (Luria-Bertani) con 50 μg/mL di kanamicina da -80 °C. Far crescere i batteri per 16 - 18 ore a 37 °C.
2. Prelevare una singola colonia dalla piastra notturna e coltivare in un terreno da 3 mL LB con 50 μg/mL di kanamicina per 16 - 18 ore in un incubatore a 37 °C a 220 giri/min.
3. Subcoltura dei batteri (diluizione 1:100) in kanamicina (50 μg/mL) contenente brodo LB per 2,5 - 3 ore in un incubatore a 37 °C a 200 giri/min. (Ad esempio, aggiungere 2 mL di batteri coltivati durante la notte a 200 mL di terreno LB con kanamicina (50 μg/mL) integrata.)
4. Incubare i batteri per 2,5 - 3 ore e misurare il valore di densità ottica (OD) a 600 nm (OD₆₀₀) fino a quando il valore è compreso tra 0,9 e 1. Il numero di cellule batteriche ha una densità di circa^10-8 unità formanti colonie (CFU)/mL.
5. Centrifugare i batteri ricoltivati a 8.000 x g per 30 min, 4 °C.
6. Scartare il surnatante senza agitare il pellet batterico e lavare il pellet con 100 mL di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% agitando delicatamente.
7. Ripetere i passaggi 1.5 e 1.6 una volta.
8. Dopo il lavaggio, centrifugare la coltura batterica a 8.000 x g per 30 minuti, 4 °C, ed eliminare delicatamente il surnatante.
9. Condensare il pellet 100 volte con soluzione fisiologica sterile allo 0,9%. Ad esempio, se vengono centrifugati 200 mL di batteri, aggiungere 2 mL di soluzione fisiologica normale per sospendere il pellet.
10. Confermare la CFU dei batteri (dovrebbe essere di circa^10-9 UFC/100 μL dopo la condensazione in soluzione fisiologica normale) placcando i batteri concentrati attraverso una diluizione seriale di 10 volte.

Risultati

Figura 1: Cronologia del diagramma di flusso della preparazione sperimentale.

Panoramica dei tempi necessari per preparare i batteri EHEC bioluminescenti e pretrattare i topi con streptomicina. (A) Preparazione EHEC. (B) Preparazione dei topi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incubatore a scuotimento	YIH DER	LM-570R	incubazione di batteri
Incubatore con agitazione orbitale	FIRSTEK	S300	incubazione di batteri
Glicerolo	SIGMA	G5516-1L	Utilizzare per la soluzione di stoccaggio dei batteri
Cloruro di sodio	Sigma	31434-5KG-R	prodotto chimico per la produzione di terreno LB, 10 g/L
Triptone	CONDA pronadisa	Gatto 1612.00	prodotto chimico per la produzione di terreno LB, 10 g/L
Estratto di lievito in polvere	Affymetrix	23547-1 KG	prodotto chimico per la produzione di terreno LB, 5 g/L
Agar	CONDA pronadisa	Gatto 1802.00	prodotto chimico per la produzione di LB agar
Kanamicina	Sigma	K4000-5G	antibiotici, uso per la seleccitazione
Streptomicina	Sigma	S6501-100G	antibiotici, eliminare il microbiota nei topi
Centrifuga ad alta velocità	Beckman Coulter	Avanti, J-26S XP	Utilizzo per la centrifugazione dei batteri
Rotore ad angolo fisso	Beckman Coulter	JA25.5	Utilizzo per la centrifugazione dei batteri
Rotore ad angolo fisso	Beckman Coulter	JLA10.5	Utilizzo per la centrifugazione dei batteri
Flaconi da centrifuga	Beckman Coulter	REF357003	Utilizzo per la centrifugazione dei batteri
Flaconi da centrifuga	Thermo Fisher scientifico	3141-0500	Utilizzo per la centrifugazione dei batteri
Biofotometro Eppendorf plus	Eppendorf	AG 22331 amburgo	per la misurazione del valore OD600 dei batteri