Isolamento di batteri resistenti agli antibiotici da un campione d'acqua per l'analisi molecolare

Abstract

Fonte: Ghadigaonkar, D. e Rath, A. Isolamento e identificazione di batteri resistenti agli antibiotici presenti nell'acqua e caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra l'isolamento e la preparazione di batteri resistenti agli antibiotici da un campione d'acqua utilizzando terreni selettivi. Il DNA viene estratto da batteri resistenti agli antibiotici e amplificato per identificare i geni batterici resistenti agli antibiotici.

Protocollo

1. Raccolta ed elaborazione dei campioni

1. Raccolta campioni
   1. Raccogliere il volume appropriato del campione d'acqua in contenitori sterili, assicurandosi che non siano riempiti più di 3/4 del contenitore.
   2. Trasportare i campioni in laboratorio in condizioni asettiche il prima possibile dopo la raccolta e processarli immediatamente.
2. Elaborazione dei campioni
   1. Filtrare asetticamente il campione d'acqua attraverso un panno di mussola sterile per rimuovere eventuali particelle.
   2. Effettuare le opportune diluizioni seriali dell'acqua filtrata per ulteriori analisi.

2. Stima della carica batterica totale e della conta batterica resistente agli antibiotici

1. Determinazione della carica batterica totale
   1. Sospendi 18,12 g di polvere modificata di agar 2A di Reasoner (agar R2A) in 1.000 ml di acqua a doppia distillazione e sciogli la miscela riscaldandola. Autoclavare la miscela disciolta a 121 °C, 15 libbre per pollice quadrato (psi) per 20 minuti. Preparare le piastre R2A Agar Modified versando la quantità appropriata della miscela autoclavata in piastre di Petri sterili (ad esempio, aggiungere circa 20 ml di terreno sterile autoclavato a una piastra di Petri sterile da 90 mm).
   2. Una volta che il terreno si è solidificato, distribuire uniformemente 100 μl delle diluizioni appropriate del campione di acqua filtrata sulla piastra R2A Agar, modificata. Eseguire l'esperimento in duplicato.
   3. Incubare tutte le piastre di cui sopra a 35 - 37 °C per 48 ore (variare la temperatura e il tempo di incubazione a seconda del terreno utilizzato per l'isolamento).
   4. Esprimere la carica batterica totale in termini di unità formanti colonie per millilitro (UFC/mL) utilizzando l'equazione (1):
2. Determinazione della carica batterica AR
   1. Segui i passaggi 2.1.1-2.1.4. Tuttavia, invece di R2A Agar, le piastre modificate utilizzano R2A Agar, piastre modificate integrate individualmente con cinque diversi antibiotici, vale a dire cefotaxima (3 μg/mL), ciprofloxacina (0,5 μg/mL), eritromicina (20 μg/mL), kanamicina (15 μg/mL) e vancomicina (3 μg/mL).
   2. Aggiungere gli antibiotici separatamente in provette contenenti 20 ml di agar R2A fuso sterile, modificato (con la temperatura dell'agar R2A fuso, modificato a ≤40 °C) per ottenere la concentrazione finale di antibiotico come indicato al punto 2.2.1.
   3. Agitare per una miscelazione uniforme e versare su piastre di Petri sterili prima che l'agar si solidifichi. Eseguire l'esperimento in duplicato.
   4. Incubare tutte le piastre di cui sopra a 35 - 37 °C per 48 ore (la temperatura e il tempo di incubazione possono variare se si utilizza un terreno diverso).
   5. Per il controllo di qualità e la verifica dell'efficacia degli antibiotici, distribuire 100 μL di sospensioni batteriche dei ceppi di Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 sulle rispettive piastre modificate R2A contenenti antibiotici (assicurarsi che la densità della coltura fresca utilizzata per l'inoculazione sia la densità ottica, OD = 0,5 a 600 nm).
   6. Determinare la conta batterica resistente agli antibiotici in termini di CFU/mL come descritto al punto 2.1.4.

3. Identificazione di batteri coltivabili mediante sequenziamento genico dell'RNA ribosomiale 16S (rRNA)

1. Preparazione del DNA stampo dagli isolati per la reazione a catena della polimerasi (PCR)
   1. Usando uno stuzzicadenti sterile, prendi una singola colonia isolata e pura dell'isolato che cresce su una piastra di Petri. Sospendi la colonia batterica in 100 μL di acqua sterile a doppia distillazione in una provetta sterile per microcentrifuga e fai bollire per 10 minuti.
   2. Centrifugare la sospensione a 10.000 × g per 2 minuti per pellettare i detriti e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga sterile fresca da utilizzare come stampo di DNA grezzo.
2. Amplificazione mirata con PCR della regione V3 del gene 16S rRNA e sequenziamento
   1. Preparare 40 μl della miscela di reazione in una provetta per PCR per l'amplificazione della PCR, come indicato nella Tabella 1.
      NOTA: La preparazione del DNA deve essere eseguita su un blocco di ghiaccio riducendo al minimo la possibilità di contaminazione (indossare guanti durante la manipolazione dei reagenti e pulire accuratamente la superficie di lavoro con etanolo al 70%).
   2. Posizionare la provetta nel blocco termico ed eseguire il programma appropriato nel termociclatore PCR. Vedere la Tabella 2 per le condizioni standardizzate del ciclo della PCR e le informazioni sul primer per l'amplificazione delle regioni V3 dei geni 16S rRNA.

Tabella 1: Componenti della mastermix PCR. La composizione della miscela di reazione di vari reagenti PCR.

Reagenti per PCR	Volume (μL)
2x Taq Master Mix	20
Innesco in avanti (10 pico mole)	1.5
Innesco inverso (10 pico mole)	1.5
Modello di DNA grezzo	1.5
Acqua sterile di biologia molecolare	15.5
Volume totale	40

 

 

 

 

 

 

 

Tabella 2: Condizioni del ciclo PCR per l'amplificazione del gene 16S rRNA. Vengono mostrate le condizioni del ciclo PCR necessarie per l'amplificazione del gene 16S rRNA. Le fasi includono una fase iniziale di denaturazione, seguita da 35 cicli di denaturazione, ricottura ed estensione e una fase finale di estensione.

Direzione	Sequenza Primer 5' – 3'	Condizioni PCR	No. di cicli
Inoltrare	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C per 10 min	1
		Denaturazione a 94 °C per 30 s	35
		Ricottura a 50 °C per 30 s
		Estensione a 72 °C per 40 s
Inverso	CTACCGGGGTATCTAATCC	Prolungamento finale a 72 °C per 5 min	1

Materiali