Un sistema di co-coltivazione per studiare le risposte molecolari delle piante ospiti e dei batteri interagenti

In questo articolo

Abstract

Fonte: Nathoo, N., et al. Un sistema di co-coltivazione idroponica per l'analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari pianta/microbo e della segnalazione. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video mostra un sistema di co-coltivazione idroponica per lo studio delle interazioni pianta-batteri in condizioni sterili. Le piantine delle piante vengono trasferite in un terreno di coltura sterile e acido, incubate e ispezionate per verificare la presenza di contaminazioni prima dell'inoculazione con Agrobacterium. I batteri attivati si attaccano alle radici delle piante, trasferiscono il T-DNA nelle cellule vegetali e promuovono cambiamenti molecolari che migliorano la colonizzazione batterica.

Protocollo

1. Sistema di co-coltivazione idroponica

Preparare il terreno liquido di Murashige e Skoog (MS): 2,165 g/L di sali basali MS, 10 g/L di saccarosio, 0,25 g/L di acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES) e 59 mL/L di miscela vitaminica B5, pH 5,75.
Autoclavare il fluido. Versarne 18 mL in ogni serbatoio cilindrico sterile in vetro o plastica trasparente (piastre di cristallizzazione, 100 x 80 mm2) con coperchi sterili.
NOTA: Presterilizzare i serbatoi e i coperchi avvolgendoli in un foglio di alluminio e sterilizzandoli in autoclave.
In una cappa a flusso sterilizzata, utilizzare una pinza sterile per trasferire delicatamente ogni quadrato a rete con piantine di 10-14 giorni dal terreno semisolido a una vasca cilindrica idroponica (Figura 1d). Sigillare i coperchi sui serbatoi utilizzando del nastro chirurgico poroso.
Coltivare le piantine sulla rete in vasca per 72 ore a 22-24 °C, con fotoperiodo di 16 ore e agitazione a 50 giri/min per l'aerazione (Figura 1e).
NOTA: Ciò consente alle piante di adattarsi all'ambiente idroponico prima dell'inoculazione (cocoltivazione) con microrganismi. Questo periodo di attesa consentirà inoltre di manifestare una contaminazione microbica accidentale prima dell'inoculazione.
1. Iniziare il passaggio successivo il giorno prima della fine del periodo di incubazione.
Coltivare l'Agrobacterium tumefaciens in terreno di coltura agrobacterium (AB) (0,5% p/v estratto di lievito, 0,5% p/v triptone, 0,5% p/v saccarosio, 50 mM di MgSO₄, pH 7,0) a 28 °C agitando per una notte fino a quando la coltura raggiunge una densità ottica finale di 1,0 a 600 nm (OD₆₀₀), misurata utilizzando uno spettrofotometro, con terreno AB non inoculato come bianco.
NOTA: Un OD₆₀₀ di 1,0 equivale a circa^10-9 cellule/mL.
Lavare l'A. tumefaciens tre volte in un volume uguale di NaCl allo 0,85%. Risospendere in un volume uguale di acqua sterile a doppia distillazione.
Prima dell'inoculazione, esaminare attentamente la vasca con le piantine per assicurarsi che non vi siano contaminazioni; Il fluido nelle vasche non contaminate deve essere limpido e trasparente.
1. Scartare qualsiasi serbatoio con liquido torbido (contaminazione) e numerare il resto dei serbatoi. Campionare una piccola quantità (20 μL) di terreno idroponico da ciascun serbatoio numerato e posizionarlo su una capsula di Petri riempita con brodo Luria (LB). Incubare la capsula a 28 °C.
Immediatamente, aggiungere 50 μl della sospensione di A. tumefaciens (circa 5 x 10⁷ cellule, stimate da OD₆₀₀) in ciascuna vasca idroponica numerata. Cocoltivare le piantine di Arabidopsis thaliana e A. tumefaciens a 22-24 °C con un fotoperiodo di 16 ore e agitazione a 50 giri/min (Figura 3f).
1. Esaminare la piastra LB maculata dal passaggio 1.7.1. Dopo 12 e 28 ore di incubazione per verificare la sterilità dei serbatoi. In caso di contaminazione, non utilizzare il serbatoio numerato corrispondente (inoculato con batteri) per ulteriori saggi a valle.
Se lo si desidera, monitorare la crescita di A. tumefaciens a intervalli regolari rimuovendo un campione di terreno dal serbatoio e misurando l'OD₆₀₀ utilizzando uno spettrofotometro con terreno proveniente da un controllo non inoculato come bianco (Figura 2).
NOTA: I sintomi della malattia delle piante dovrebbero essere evidenti dopo 7 giorni (Figura 3).

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Risultati

Figura 1: Sistema idroponico di cocoltivazione pianta-microbi. Il pannello di sinistra rappresenta un diagramma di flusso che delinea i sei passaggi chiave per l'assemblaggio e il funzionamento del sistema di co-coltivazione idroponica. Il pann...