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1. Preparazione della soluzione
- Preparare 1 M di Tris-Cl, pH 7,8 sciogliendo 10,34 g di Tris HCl e 4,17 g di Tris OH in 50 mL di dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conservare in una provetta conica a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione A (20 mM di MgCl2, 0,7 M di saccarosio, 10 mM di Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,10 g di MgCl2 (95,2 g/mol) e 11,98 g di saccarosio (342,3 g/mol) in 25 mL di dH2O in un matraccio da 125 mL. Aggiungere 500 μl di Tris-Cl 1 M (pH 7,8) e regolare il volume a 50 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conservare in una provetta conica a temperatura ambiente.
- Preparare la soluzione B (10 mM di MgCl2, 0,8 M di saccarosio, 10 mM di Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,05 g di MgCl2 (95,2 g/mol) e 13,69 g di saccarosio (342,3 g/mol) in 25 mL di dH2O in un matraccio da 125 mL. Aggiungere 500 μl di Tris-Cl 1 M (pH 7,8) e regolare il volume a 50 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conservare in una provetta conica a temperatura ambiente.
- Preparare 0,8 M di saccarosio sciogliendo 13,69 g di saccarosio (342,3 g/mol) in 50 mL dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conservare in una provetta conica a temperatura ambiente.
- Preparare 5 mg/mL di desossiribonucleasi I (DNasi I) sciogliendo 0,015 g di DNasi I in 3 mL di dH2O in un matraccio da 50 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm. Aliquotare la soluzione in provette per microfusibili e conservare a -20 °C.
- Preparare l'acido etilendiamminotetraacetico 0,125 M (EDTA), pH 8,0 sciogliendo 0,698 g di EDTA disodico disidrato (372,2 g/mol) in 15 mL dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conservare in una provetta conica a temperatura ambiente.
- Preparare 600 μg/mL di cefalexina sciogliendo 0,03 g di idrato di cefalexina (365,404 g/mol) in 50 mL di dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conservare in una provetta conica a 4 °C.
- Preparare 5 mg/mL di lisozima sciogliendo 0,015 g di lisozima in 3 mL di dH2O in un matraccio da 50 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm. Aliquotare la soluzione in provette per microfusibili e conservare a -20 °C.
- Preparare il 3% p/v di Brodo di Soia Tripticasica (TSB) sciogliendo 30 g di TSB in 1 L di dH2O in un pallone da 2 L. Aliquotare la soluzione in matracci contenenti 25 mL o 100 mL di TSB da utilizzare nella preparazione di E. coli sferoplasti. Palloni per autoclave per sterilizzare il mezzo liquido. Il TSB sterile può essere conservato a temperatura ambiente o a 4 °C.
2. Preparazione della cultura notturna
NOTA: Eseguire le sezioni 2-3 utilizzando tecniche sterili appropriate. Se lo si desidera, un ceppo batterico può contenere un plasmide per la resistenza agli antibiotici per ridurre la potenziale contaminazione. Se si utilizza un ceppo con resistenza agli antibiotici, aggiungere gli antibiotici necessari nei passaggi 2.1 e 3.1-3.2.
- Preparare una coltura notturna prelevando una singola colonia di batteri utilizzando un puntale di pipetta sterile e inserendola in una provetta di coltura da 14 mL contenente 2-3 mL di TSB al 3% p/v. Incubare a 37 °C, agitando per 16-21 ore.
3. Preparazione di sferoplasti di E. coli Gram-negativi
- In un matraccio da 250 mL, diluire la coltura notturna 1:100 in 25 mL di volume al 3% p/v TSB e incubare la soluzione batterica a 37 °C, agitando per circa 2,5 ore fino a quando la soluzione non ha raggiunto una densità ottica di 0,5-0,8 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.
- In un matraccio da 250 mL, diluire questa coltura 1:10 in 30 mL di TSB al 3% p/v e incubare a 37 °C, agitando per 2,5 ore in presenza di 60 μg/mL di cefalexina (347,4 g/mol) per produrre filamenti di singole cellule di circa 50-150 μm di lunghezza, osservabili con un ingrandimento di 1.000X utilizzando un microscopio ottico (Figura 1B).
- Raccogliere i filamenti centrifugando la soluzione batterica a 1.500 x g, 4 °C per 4 min. Decantare e scartare il surnatante, riservando il pellet.
- Lavare i filamenti aggiungendo delicatamente 1 mL di saccarosio 0,8 M, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Incubare per 1 minuto, quindi scartare il surnatante senza disturbare il pellet.
- Aggiungere 150 μL di Tris-Cl 1 M (pH 7,8), 120 μL di lisozima da 5 mg/mL, 30 μL di DNasi I da 5 mg/mL e 120 μL di EDTA 0,125 M nel rispettivo ordine al pellet e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Aggiungere 1 mL di soluzione A gradualmente nell'arco di 1 minuto alla soluzione preparata in 3,5 utilizzando una micropipetta e agitando delicatamente la soluzione a mano. Incubare la soluzione per 4 minuti a temperatura ambiente.
- Mettere 7 mL di soluzione B a 4 °C in due provette coniche da 15 mL. Aggiungere quantità uguali della soluzione preparata al punto 3.6 a ciascuna di queste due provette. Centrifugare la soluzione a 1.500 x g, 4 °C per 4 min.
- Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere con cura tutto tranne 1-2 mL di surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet pipettandolo delicatamente su e giù con una micropipetta P1000. Controllare visivamente la formazione degli sferoplasti osservando il campione con un ingrandimento di 1.000X utilizzando un microscopio ottico (Figura 1C).
- Conservare gli sferoplasti a -20 °C per un massimo di una settimana o fino a quando non hanno superato 3 cicli di gelo-scongelamento.
