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1. Preparazione della soluzione
- Preparare 5 mg/mL di lisozima sciogliendo 0,015 g di lisozima in 3 mL di dH2O in un matraccio da 50 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm. Aliquotare la soluzione in provette per microfusibili e conservare a -20 °C.
- Preparare il 3% p/v di Brodo di Soia Tripticasica (TSB) sciogliendo 30 g di TSB in 1 L di dH2O in un pallone da 2 L. Aliquotare la soluzione in matracci contenenti 100 mL di TSB da utilizzare nella preparazione dei protoplasti di B. megaterium . Palloni per autoclave per sterilizzare il mezzo liquido. Il TSB sterile può essere conservato a temperatura ambiente o a 4 °C.
- Preparare la soluzione C (1 M di saccarosio, 0,04 M di maleato, 0,04 M di MgCl2, pH 6,5) sciogliendo 34,23 g di saccarosio (342,3 g/mol), 0,46 g di acido maleico (116,07 g/mol) e 0,38 g di MgCl2 (95,21 g/mol) in 100 mL di dH2O in un matraccio da 250 mL. Regolare il pH a 6,5. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conservare in una provetta conica a temperatura ambiente.
- Preparare 200 mL di terreno protoplasto mescolando 100 mL di TSB al 3% e 100 mL di soluzione C in un flacone di vetro da 1 L. Autoclave per sterilizzare la soluzione e conservare a temperatura ambiente.
2. Preparazione di protoplasti Gram-positivi di B. megaterium
- In un matraccio da 250 mL, diluire la coltura notturna 1:1.000 in 100 mL di TSB al 3% p/v e incubare la soluzione batterica a 37 °C, agitando per circa 4,5 ore fino a quando la soluzione non ha raggiunto una densità ottica di 0,9-1,0 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.
- Versare la coltura liquida in due provette coniche da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 °C per 10 minuti.
- Utilizzando una pipetta sierologica, scartare il surnatante da entrambe le provette coniche. Risospendere ogni pellet in 2,5 mL di terreno protoplastico e combinare le soluzioni risospese in un unico tubo conico. Pipettare la soluzione risospesa combinata in un matraccio da 125 mL.
- Aggiungere 1 mL di lisozima da 5 mg/mL e incubare per 1 ora a 37 °C, agitando.
- Monitorare la crescita dei protoplasti con un ingrandimento di 1.000x utilizzando un microscopio ottico, notando eventuali irregolarità, come i batteri che appaiono come bastoncelli gonfi invece che sfere (Figura 1). Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 °C per 10 minuti.
- Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno protoplasto. Conservare i protoplasti a -20 °C per un massimo di una settimana o fino a quando non sono stati sottoposti a 3 cicli di gelo-scongelamento.
