Generazione di protoplasti dal batterio Gram-positivo Bacillus megaterium

Abstract

Fonte: Figueroa, D. M., et al. Produzione e visualizzazione di sferoplasti e protoplasti batterici per caratterizzare la localizzazione di peptidi antimicrobici. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra una procedura passo dopo passo per la generazione di protoplasti dal batterio Gram-positivo Bacillus megaterium.

Protocollo

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare 5 mg/mL di lisozima sciogliendo 0,015 g di lisozima in 3 mL di dH₂O in un matraccio da 50 mL. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm. Aliquotare la soluzione in provette per microfusibili e conservare a -20 °C.
2. Preparare il 3% p/v di Brodo di Soia Tripticasica (TSB) sciogliendo 30 g di TSB in 1 L di dH₂O in un pallone da 2 L. Aliquotare la soluzione in matracci contenenti 100 mL di TSB da utilizzare nella preparazione dei protoplasti di B. megaterium . Palloni per autoclave per sterilizzare il mezzo liquido. Il TSB sterile può essere conservato a temperatura ambiente o a 4 °C.
3. Preparare la soluzione C (1 M di saccarosio, 0,04 M di maleato, 0,04 M di MgCl₂, pH 6,5) sciogliendo 34,23 g di saccarosio (342,3 g/mol), 0,46 g di acido maleico (116,07 g/mol) e 0,38 g di MgCl₂ (95,21 g/mol) in 100 mL di dH₂O in un matraccio da 250 mL. Regolare il pH a 6,5. Sterilizzare filtrando attraverso un filtro per siringa da 25 mm con membrana da 0,2 μm e conservare in una provetta conica a temperatura ambiente.
4. Preparare 200 mL di terreno protoplasto mescolando 100 mL di TSB al 3% e 100 mL di soluzione C in un flacone di vetro da 1 L. Autoclave per sterilizzare la soluzione e conservare a temperatura ambiente.

2. Preparazione di protoplasti Gram-positivi di B. megaterium

1. In un matraccio da 250 mL, diluire la coltura notturna 1:1.000 in 100 mL di TSB al 3% p/v e incubare la soluzione batterica a 37 °C, agitando per circa 4,5 ore fino a quando la soluzione non ha raggiunto una densità ottica di 0,9-1,0 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.
2. Versare la coltura liquida in due provette coniche da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 °C per 10 minuti.
3. Utilizzando una pipetta sierologica, scartare il surnatante da entrambe le provette coniche. Risospendere ogni pellet in 2,5 mL di terreno protoplastico e combinare le soluzioni risospese in un unico tubo conico. Pipettare la soluzione risospesa combinata in un matraccio da 125 mL.
4. Aggiungere 1 mL di lisozima da 5 mg/mL e incubare per 1 ora a 37 °C, agitando.
5. Monitorare la crescita dei protoplasti con un ingrandimento di 1.000x utilizzando un microscopio ottico, notando eventuali irregolarità, come i batteri che appaiono come bastoncelli gonfi invece che sfere (Figura 1). Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 °C per 10 minuti.
6. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno protoplasto. Conservare i protoplasti a -20 °C per un massimo di una settimana o fino a quando non sono stati sottoposti a 3 cicli di gelo-scongelamento.

Risultati

Figura 1: Immagini rappresentative di B. megaterium. (A) batteri B. megaterium e (B) B. megaterium protoplast. Le immagini sono state scattate con un ing...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di magnesio	Sigma	Codice: M8266
Saccarosio	Sigma	S7903
Lisozima	Sigma	L6876
BBL Brodo di soia Trypticase	Fisher Scientifico	B11768
Acido maleico	Sigma	Codice: M0375
Filtro per siringa Acrodisc da 25 mm con membrana HT Tuffryn da 0,2 μm	Società Pall	4192