Valutazione della transcitosi di E. coli attraverso i monostrati epiteliali intestinali

Abstract

Fonte: Islam, A., et al., Valutazione della transcitosi intestinale degli isolati di batteriemia neonatale di Escherichia coli . J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra la procedura per valutare la transcitosi dell'Escherichia coli neonatale attraverso i monostrati epiteliali intestinali utilizzando inserti transwell, misurazione della resistenza elettrica e quantificazione batterica.

Protocollo

1. Inoculazione delle cellule (inizio dell'esperimento)

1. Dopo esattamente 2 ore, rimuovere le colture batteriche mattutine dall'agitatore e centrifugarle per 10 minuti (1.900 x g, 4 °C).
   NOTA: Per tutti i passaggi successivi, mantenere tutte le sospensioni batteriche sul ghiaccio per ridurre al minimo la crescita.
2. Risospendere il pellet batterico nel terreno di coltura tissutale (MTC) senza antibiotici. Utilizzare uno spettrofotometro per regolare la densità ottica (OD) a 0,7-0,9 e diluire ulteriormente con MTC senza antibiotici a una concentrazione di 1 x 10⁶ unità formanti colonie (CFU)/mL (diluizione circa 1:100). Utilizzare questa sospensione batterica per infettare ogni inserto con 1 x 10⁵ CFU per 100 μL di volume.
3. Etichettare la piastra transwell e infettare ciascun inserto con 100 μl di inoculo aggiustato per OD (per un totale di 1 x 10⁵ CFU per inserto). Il test è ora iniziato. Annotare l'ora e registrarla come t = 0 h.
4. Piastra la sospensione batterica dell'inoculo per quantificare le CFU/mL utilizzando il metodo della diluizione della traccia, piastrando aliquote da 10 μL su piastre quadrate di agar LB.

2. Quantificazione della transcitosi

1. Ogni 30 minuti dopo l'inoculazione, riempire i nuovi pozzetti con 500 μL di MTC senza antibiotici. Trasferire gli inserti in questi nuovi pozzetti utilizzando un set diverso di pinze sterili per ogni diverso ceppo batterico.
2. Raccogliere il terreno dal pozzetto di raccolta usato per ciascun inserto in provette etichettate separate. Metti questi tubi sul ghiaccio. Tra un punto temporale e l'altro, riportare le piastre del pozzetto all'incubatrice.
3. Per ogni inserto, combinare il terreno raccolto da t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h e t = 2 h e agitare brevemente. Piastra i terreni raccolti su piastre di agar Luria-Bertani (LB) utilizzando il metodo della diluizione a traccia per quantificare la quantità di batteri transcitosi nelle prime 2 ore dell'esperimento.
   NOTA: Il recupero dei batteri ogni 30 minuti e il loro mantenimento sul ghiaccio riduce al minimo la crescita batterica nei pozzetti di raccolta e le misurazioni vengono effettuate prevalentemente su batteri della transcitosi.
4. Collocare le piastre di agar LB di diluizione a traccia etichettate nell'incubatore batterico a 37 °C senza CO₂ supplementare e rimettere la piastra transwell T84 nell'incubatore per colture tissutali.
5. A t = 4 h, ripetere il passaggio 2.3 combinando i terreni raccolti da t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h e t = 4 h.
6. A t = 6 h, ripetere il passaggio 2.3 combinando i terreni raccolti da t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h e t = 6 h. Inoltre, a t = 6 h, piastrate il fluido dai pozzetti di controllo.

3. Fine dell'esperimento

1. Misurare e registrare la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) alla fine dell'esperimento, t = 6 h.
2. Decontaminare la sonda immergendola in etanolo al 70% per 10-15 minuti. Se lo si desidera, eliminare gli inserti o salvarli/lavorarli per ulteriori applicazioni. Lasciare incubare le piastre di agar LB durante la notte e disinfettare e/o smaltire in sicurezza tutti gli altri materiali utilizzati.
3. Dopo l'incubazione notturna, contare manualmente le colonie batteriche sulle piastre LB di diluizione per determinare la quantità di inoculo e la quantità di transcitosi di E. coli . Assicurarsi che le piastre di controllo non mostrino alcuna crescita batterica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette coniche sterili da 15 mL	MidSci	C15B
Provette per microcentrifuga da 2 mL	Avant	AVSS2000
Provette coniche sterili in polipropilene da 50 mL	Falcone	352070
Centrifuga	Sorvall	Leggenda RT
Anse di inoculazione monouso	Fisherbrand	22363605
Eagle Medium modificato di Dulbecco (DMEM)	Gibco	11965-084
Misuratore epiteliale di volt/ohm	Strumenti di precisione mondiali	EVOM
Agitatore per incubatore	New Brunswick	Innova 4080
Incubatrici	Termo Scientifico	51030284	Tre di questi sono utilizzati nel metodo: uno per la coltura di tessuti sterili, uno per la coltura di tessuti infetti e uno per l'incubazione batterica.
Brodo di lisogenia	Difco	244610
Brodo di lisogenia agar	IBI Scientifico	IB49101
Spettrofotometro	Unico	1100RS
Cellule intestinali T84	Collezione di colture di tessuti americani	CCL248
Inserti per colture tissutali, con membrana in polietilene treftalato, pori da 3 μm, formato da 24 pozzetti	Falcone	353096
Piastra per coltura tissutale, 24 pozzetti	Falcone	353504