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1. Inoculazione delle cellule (inizio dell'esperimento)
- Dopo esattamente 2 ore, rimuovere le colture batteriche mattutine dall'agitatore e centrifugarle per 10 minuti (1.900 x g, 4 °C).
NOTA: Per tutti i passaggi successivi, mantenere tutte le sospensioni batteriche sul ghiaccio per ridurre al minimo la crescita. - Risospendere il pellet batterico nel terreno di coltura tissutale (MTC) senza antibiotici. Utilizzare uno spettrofotometro per regolare la densità ottica (OD) a 0,7-0,9 e diluire ulteriormente con MTC senza antibiotici a una concentrazione di 1 x 106 unità formanti colonie (CFU)/mL (diluizione circa 1:100). Utilizzare questa sospensione batterica per infettare ogni inserto con 1 x 105 CFU per 100 μL di volume.
- Etichettare la piastra transwell e infettare ciascun inserto con 100 μl di inoculo aggiustato per OD (per un totale di 1 x 105 CFU per inserto). Il test è ora iniziato. Annotare l'ora e registrarla come t = 0 h.
- Piastra la sospensione batterica dell'inoculo per quantificare le CFU/mL utilizzando il metodo della diluizione della traccia, piastrando aliquote da 10 μL su piastre quadrate di agar LB.
2. Quantificazione della transcitosi
- Ogni 30 minuti dopo l'inoculazione, riempire i nuovi pozzetti con 500 μL di MTC senza antibiotici. Trasferire gli inserti in questi nuovi pozzetti utilizzando un set diverso di pinze sterili per ogni diverso ceppo batterico.
- Raccogliere il terreno dal pozzetto di raccolta usato per ciascun inserto in provette etichettate separate. Metti questi tubi sul ghiaccio. Tra un punto temporale e l'altro, riportare le piastre del pozzetto all'incubatrice.
- Per ogni inserto, combinare il terreno raccolto da t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h e t = 2 h e agitare brevemente. Piastra i terreni raccolti su piastre di agar Luria-Bertani (LB) utilizzando il metodo della diluizione a traccia per quantificare la quantità di batteri transcitosi nelle prime 2 ore dell'esperimento.
NOTA: Il recupero dei batteri ogni 30 minuti e il loro mantenimento sul ghiaccio riduce al minimo la crescita batterica nei pozzetti di raccolta e le misurazioni vengono effettuate prevalentemente su batteri della transcitosi. - Collocare le piastre di agar LB di diluizione a traccia etichettate nell'incubatore batterico a 37 °C senza CO2 supplementare e rimettere la piastra transwell T84 nell'incubatore per colture tissutali.
- A t = 4 h, ripetere il passaggio 2.3 combinando i terreni raccolti da t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h e t = 4 h.
- A t = 6 h, ripetere il passaggio 2.3 combinando i terreni raccolti da t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h e t = 6 h. Inoltre, a t = 6 h, piastrate il fluido dai pozzetti di controllo.
3. Fine dell'esperimento
- Misurare e registrare la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) alla fine dell'esperimento, t = 6 h.
- Decontaminare la sonda immergendola in etanolo al 70% per 10-15 minuti. Se lo si desidera, eliminare gli inserti o salvarli/lavorarli per ulteriori applicazioni. Lasciare incubare le piastre di agar LB durante la notte e disinfettare e/o smaltire in sicurezza tutti gli altri materiali utilizzati.
- Dopo l'incubazione notturna, contare manualmente le colonie batteriche sulle piastre LB di diluizione per determinare la quantità di inoculo e la quantità di transcitosi di E. coli . Assicurarsi che le piastre di controllo non mostrino alcuna crescita batterica.