Questo video mostra la preparazione di una coltura di Borrelia burgdorferi geneticamente modificata ingegnerizzata con DNA batteriofago dormiente che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici. Dopo la selezione e l'incubazione degli antibiotici, un induttore chimico innesca il danno al DNA, portando all'escissione, alla replicazione e all'assemblaggio di nuovi virioni contenenti il gene di resistenza. Dopo una seconda centrifugazione e risospensione, le cellule batteriche che ospitano particelle virali mature sono pronte per le applicazioni a valle.
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Articolo metodologico
Preparazione e induzione di colture di Borrelia burgdorferi per la produzione di particelle virali
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26 settembre 2025
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Preparazione della coltura di B. burgdorferi per la produzione di φBB-1
- Preparare il terreno Barbour-Stoenner-Kelly integrato con il 6,6% di siero normale di coniglio (BSK) inattivato termicamente. Per 1 L di 1x BSK, combinare i componenti elencati nella Tabella 1 in 900 mL di acqua, regolare il pH a 7,6 utilizzando 1 N di idrossido di sodio e mescolare lentamente a 4 °C per 2-4 ore. Al termine della miscelazione, controllare e regolare nuovamente il pH a 7,6, se necessario, e aumentare il volume a 1 L con acqua. Sterilizzare il terreno passando attraverso un filtro da 0,22 μM (vedi Tabella dei materiali) e utilizzare fresco o conservare a 4 °C per ≤2 mesi.
- Da tre a cinque giorni prima di iniziare il protocollo di trasduzione, inoculare 150 μL del/i clone/i appropriato/i di B. burgdorferi in 15 mL di 1x BSK in provette da centrifuga coniche sterili con tappo ermetico (vedere la Tabella dei materiali). Integrare il terreno con l'appropriata concentrazione di antibiotici o una combinazione di antibiotici per la selezione e il mantenimento del DNA eterologo all'interno del/i clone/i di B. burgdorferi (Tabella 2).
NOTA: B. burgdorferi è un organismo di livello 2 di biosicurezza. Prendi tutte le precauzioni appropriate mentre lavori con questo organismo. Eseguire tutti i lavori con colture vive di B. burgdorferi in una cappa di biosicurezza di classe II certificata e adeguatamente disinfettata. Smaltire correttamente tutto il materiale che entra in contatto con B. burgdorferi e gli organismi stessi in base alle linee guida dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC). - Incubare le colture a 33 °C senza agitare fino a quando le colture raggiungono una densità di ≥5 × 107 spirochete·mL−1, che richiede circa 3-5 giorni.
3. Induzione del fago φBB-1 di B. burgdorferi
NOTA: Sterilizzare tutta la vetreria e la plastica in autoclave; sterilizzare tutte le soluzioni in autoclave o filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μM. I passaggi seguenti sono presentati sulla base di volumi di 15 ml, ma il metodo è scalabile a volumi più piccoli o più grandi a seconda delle esigenze individuali dell'esperimento.
- Per la coltura di B. burgdorferi da cui verrà prodotto il fago (il donatore), utilizzare la concentrazione calcolata con uno dei due metodi nella fase 2 per determinare il volume di coltura starter necessario per produrre 4 mL di 2 × 108 spirochete·mL−1. Ciò produrrà una concentrazione finale di 5 × 107 spirochete·mL−1 in 15 mL durante la fase di recupero (punto 3.6 di seguito).
- Centrifugare il volume di coltura calcolato al punto 3.1 a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 4 mL di BSK fresco. Trasferire il campione nella provetta sterile più piccola disponibile per contenere il campione con uno spazio di testa minimo.
- Aggiungere la quantità appropriata di agente induttore alla concentrazione raccomandata (Tabella 3) sulla base di un volume di coltura di 4 mL per indurre la produzione di fagi. Tappare bene il tubo e mescolare accuratamente.
- Incubare il campione a 33 °C per 2-4 ore.
- Dopo l'incubazione, trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare il campione a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 15 mL di 1x BSK.
Tabella 1: BSK per la coltivazione e la selezione di cloni di B. burgdorferi per saggi di trasduzione. La formulazione e la preparazione di 1x BSK per la coltura di B. burgdorferi e 1,5x BSK per la selezione in fase solida dei cloni di B. burgdorferi qui descritti si basano su Samuels. Diverse formulazioni di BSK (o MKP) che supportano la crescita di B. burgdorferi non sono ancora state testate utilizzando il saggio di trasduzione.
| Componente | 1x BSK (per la coltivazione) (1 L) | 1,5x BSK (per placcatura) (1 L) |
| Albumina sierica bovina (frazione V) | 35 g | 52,5 g |
| 10x CMRL-1066 (senza L-glutammina) | 8 g | 12 g |
| Neopeptone | 4 g | 6 g |
| lievitato | 1,6 g | 2,4 g |
| HEPES | 4,8 g | 7,2 g |
| Glucosio | 4 g | 6 g |
| Citrato di sodio | 0,56 g | 0,84 g |
| Piruvato di sodio | 0,64 g | 0,96 g |
| N-acetil-glucosamina | 0,32 g | 0,48 g |
| Bicarbonato di sodio | 1,76 g | 2,64 g |
| Siero normale di coniglio inattivato a caldo (INRS) | 66 ml | 99 ml |
Tabella 2: Potenziali antibiotici e concentrazioni da utilizzare per la selezione e il mantenimento del DNA eterologo in B. burgdorferi. Questo elenco si basa sugli attuali marcatori di resistenza agli antibiotici comunemente usati in Borrelia burgdorferi. La kanamicina, la gentamicina e la streptomicina vengono preparate in acqua, sterilizzate con filtro attraverso un filtro da 0,22 μM e conservate a -20 °C. L'eritromicina viene preparata in etanolo al 95% e conservata a -20 °C. Molti laboratori riportano il successo dell'uso della kanamicina per la selezione a una concentrazione di 200 μg·mL-1; Quando si utilizzano sia la gentamicina che la kanamicina per la selezione nei saggi di trasduzione, si utilizzano 400 μg·mL−1 di kanamicina. Il gene aadA conferisce resistenza sia alla streptomicina che alla spectinomicina. Per la selezione di costrutti contenenti il gene aadA in E. coli, 100 μg·mL−1 spectinomicina. Si noti che gli aminoglicosidi (kanamicina, gentamicina e streptomicina) non sono clinicamente rilevanti nel trattamento della malattia di Lyme; Tuttavia, l'eritromicina viene utilizzata clinicamente in determinate situazioni. Sebbene sia stata segnalata una resistenza naturale a questo antibiotico in B. burgdorferi , questo marcatore di resistenza non è stato finora utilizzato nei test di trasduzione qui riportati.
| Antibiotico | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale nella cultura del Sib |
| Kanamicina | 100 mg.mL-1 (in acqua) | 200-400 μ g.mL-1 |
| Gentamicina | 50 mg.mL-1 (in acqua) | 50 μ g.mL-1 |
| Streptomicina | 50 mg.mL-1 (in acqua) | 50 μ g.mL-1 |
| Eritromicina | 2 mg.mL-1 (in EtOH) | 0,06 μ g.mL-1 |
Tabella 3: Agenti induttori di potenziale e concentrazioni utilizzate per l'induzione di φBB-1 da B. burgdorferi. È stato dimostrato che la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), la mitomicina C e l'etanolo, così come il metanolo e l'isopropanolo, inducono φBB-1 al di sopra dei livelli costitutivi nel ceppo CA.11-2A di B. burgdorferi . Il MNNG è un sospetto cancerogeno e pericoloso per l'ambiente; Utilizzare con cautela, sciogliere in un solvente combustibile e incenerire per lo smaltimento. La mitomicina C è un sospetto cancerogeno e un potenziale pericolo per l'ambiente; Utilizzare con cautela sotto una cappa chimica e smaltire correttamente. Mentre i dati pubblicati suggeriscono che il MNNG è l'agente più efficace per indurre φBB-1, i rischi di lavorare con questa sostanza chimica e le difficoltà nell'acquisirla ne rendono l'uso complicato, in particolare con gli studenti. L'induzione con etanolo è costantemente migliore rispetto al metanolo o all'isopropanolo ed è stata più comunemente utilizzata nel saggio di trasduzione.
| Agente induttivo | Concentrazione madre (solvente) | Concentrazione finale nel campione |
| Etanolo | 100% (nessuno) | 5% |
| Mitomicina C | 2 mg.mL-1 (acqua) | 20 μ g.mL-1 |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) | 50 mg.mL-1 (DMSO) | 10 μ g.mL-1 |
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Unità filtranti da 1 L (PES, dimensione dei pori 0,22 μm) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| Tubo da 12 mm x 75 mm (tappo a doppia posizione) (polipropilene) | Stati Uniti d'America Scientific | 1450-0810 | contiene 4 mL con volume di vuoti basso (per induzione) |
| Provette da centrifuga coniche da 15 mL (polipropilene) | Stati Uniti d'America Scientific | 5618-8271 | |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) | Millipore Sigma | ATTENZIONE: potenziale cancerogeno; non più prontamente disponibile, non hanno testato offerto un sostituto | |
| Pipette Pasteur da 5,75" (con tappo di cotone/vetro borosilicato/non sterile) | Thermo Fisher Scientifico | 13-678-8A | autoclave prima dell'uso |
| Provette da centrifuga coniche da 50 mL (polipropilene) | Stati Uniti d'America Scientific | 1500-1211 | |
| Etanolo assoluto | |||
| Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Lievitolato | Gibco | 255772 | |
| Albumina sierica bovina (grado di sostituzione del siero) | Gemini Bio-Prodotti | 700-104P | |
| CMRL-1066 senza L-Glutammina (polvere) | Biologico statunitense | Codice: C5900-01 | grado di coltura cellulare |
| Eritromicina | Prodotti di ricerca International Corp | E57000-25.0 | |
| Soluzione di reagente gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| Glucosio (destrosio anidro) | Thermo Fisher Scientifico | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientifico | BP310-500 | |
| Kanamicina solfato | Thermo Fisher Scientifico | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (dimensione dei pori di 0,22 μM) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | per filtrare, sterilizzare, antibiotici e altre soluzioni di piccolo volume |
| Mitomicina C | Thermo Fisher Scientifico | BP25312 | ATTENZIONE: potenziale cancerogeno; Utilizzare solo in una cappa chimica |
| N-acetil-D-glucosamina | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Piastra di Petri (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientifico | FB0875712 | |
| Siero di coniglio non sterile in tracce emolizzato giovane (NRS) | Pel-Freez Biologici | 31119-3 | inattivazione del calore secondo le istruzioni del produttore |
| Bicarbonato di sodio | Thermo Fisher Scientifico | BP328-500 | |
| Piruvato di sodio | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Soluzione di streptomicina solfato | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Citrato trisodico diidrato | Millipore Sigma | S1804-500G | citrato di sodio per BSK |
