Rilevamento di un analita target utilizzando un biosensore batterico

Abstract

Fonte: Barber, A. E., et al. Preparazione e applicazione di un nuovo biosensore batterico per la rilevazione presuntiva di residui di arma da fuoco. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra la rilevazione di analiti specifici utilizzando un biosensore batterico. Viene prelevata una coltura batterica che trasporta un plasmide con un gene della proteina fluorescente rossa (RFP) sotto un promotore sensibile all'analita. Dopo aver pulito accuratamente la superficie del test, una piccola sezione della salvietta viene immersa nella coltura e incubata. L'interazione dell'analita con il promotore attiva l'espressione di RFP, confermando la presenza dell'analita target.

Protocollo

NOTA: Viene presentata la sintesi di E. coli che esprime la proteina fluorescente rossa (RFP).

1. Preparazione di acido desossiribonucleico plasmidico (DNA) da E. coli

1. Scongelare E.coli contenente un plasmide con un gene RFP e un gene di resistenza all'ampicillina e far crescere E.coli su piastre di agar Luria Broth (LB) contenenti 100 μg/mL di ampicillina a 37 °C per 24 ore. Ad esempio, utilizzare il plasmide J10060 dal registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (vedi Tabella dei materiali). Il plasmide J10060 include un gene per RFP sotto il controllo di una regione del promotore pBad e un gene di resistenza all'ampicillina. In alternativa, trasformare E.coli (fare riferimento al passaggio 3.2) con il plasmide prima della crescita sulle piastre di agar LB.
2. Seguire un protocollo miniprep standard (vedere la Tabella dei materiali) per isolare il DNA da 1 ml di una coltura di E. coli che contiene il plasmide J10060. Lo scopo del seguente protocollo è quello di rimuovere il promotore pBad e sostituirlo con il promotore desiderato per il dispositivo.
3. Dopo il miniprep plasmidico, conservare il DNA nel congelatore fino al momento della digestione.

2. Digestione enzimatica di restrizione

1. Impostare la seguente reazione in una provetta da microcentrifuga per la digestione EcoRI e NheI: 10 μL di DNA plasmidico J10060 (isolato nella fase 1), 8 μL di acqua e 1 μL ciascuno di enzimi EcoRI e NheI premiscelati con 1 μL di tampone (vedere la Tabella dei materiali).
2. Per il DNA del promotore, impostare la seguente reazione in una provetta da microcentrifuga per la digestione EcoRI e NheI: 10 μL di sequenze di DNA promotore ricotto (8 μL di acqua e 1 μL ciascuno di enzimi EcoRI e NheI premiscelati con 1 μL di tampone.
   1. Per l'antimonio (Sb-), il piombo (Pb-) o il trinitrotoluene (TNT)-RFP (vedere la Tabella dei materiali), sciogliere gli oligonucleotidi in tampone (30 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES), pH 7,5; 100 mM di acetato di potassio), incubare in concentrazioni molari uguali, riscaldare a 94 °C per 2 minuti e raffreddare gradualmente a temperatura ambiente).
3. Miscelare i campioni pipettandoli delicatamente su e giù con la pipetta impostata su 10 μl.
4. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
5. Inattivare gli enzimi a 80 °C per 5 minuti.
6. Conserva il DNA digerito nel congelatore fino al momento di passare alla fase successiva.

3. Legatura e trasformazione

1. Legatura
   1. Utilizzando il DNA plasmidico e il DNA del promotore che sono stati digeriti due volte con EcoRI e NheI nella fase 2, impostare la miscela di reazione mostrata nella Tabella 1 in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio; aggiungere per ultima la DNA Ligasi T4. NOTA: La Tabella 1 mostra una legatura utilizzando un rapporto molare di 1:3 vettore da inserire per le dimensioni del DNA indicate.
   2. Miscelare delicatamente la reazione pipettando su e giù e microcentrifugare brevemente.
   3. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
   4. Inattivare a calore a 65 °C per 10 min.
2. Trasformazione
   1. Scongelare una provetta con 20 μL di cellule di E. coli DH5-alfa competenti su ghiaccio fino a quando gli ultimi cristalli di ghiaccio scompaiono.
   2. Aggiungere 5 μL di DNA plasmidico alla miscela cellulare. Muovi con cautela il tubo 4-5 volte per mescolare le cellule e il DNA.
   3. Mettere il composto sul ghiaccio per 2 minuti.
   4. Shock termico a 42 °C esatti per 30 s. Non mescolare.
   5. Mettere sul ghiaccio per 2 min. Non mescolare.
   6. Pipettare nella miscela 380 μl di brodo super ottimale a temperatura ambiente con repressione dei cataboliti (SOC). Stendere immediatamente su una piastra di agar LB contenente ampicillina (100 μg/mL) e incubare per una notte a 37 °C.
   7. Controllare le piastre entro 24 ore per la crescita.
   8. Sigillare i piatti con pellicola sigillante e conservarli in frigorifero fino al momento di passare al passaggio successivo.

4. Reazione a catena della polimerasi delle colonie (PCR)

1. Aggiungere a una provetta per PCR (impostare 4 provette di reazione) le miscele di reazione mostrate nella Tabella 2.
2. Mescolare delicatamente le reazioni pipettando su e giù.
3. Usando una punta gialla per pipetta, raschiare una colonia (o una regione molto piccola) di E. coli trasformato. Trasferire una passata di questo E. coli su una nuova piastra LB/ampicillina/agar che è stata sezionata, quindi inserire la punta della pipetta nella provetta per PCR. Agitare la punta della pipetta per mescolare l'E. coli con la miscela per PCR. Ripeti altre tre volte per ulteriori colonie. Trasferire le provette per PCR in una macchina per PCR e iniziare il ciclo termico utilizzando il programma mostrato nella Tabella 3.
4. Eseguire l'elettroforesi su gel utilizzando un gel di agarosio al 2% in TAE 9Tris-Acetato-EDTA) per determinare quali colonie hanno la migliore legatura nel plasmide e far crescere tali colonie su una nuova piastra.
5. Conservare le piastre in frigorifero fino al momento di essere testate. Preparare una coltura liquida in brodo di Luria con l'aggiunta di 100 μg/mL di ampicillina per i test chimici.

5. Sequenziamento del DNA

1. Per ogni campione, aggiungere 5 μl di plasmide, 4 μl di primer di sequenziamento e 3 μl di acqua deionizzata.
2. Mettere questa miscela in una provetta e inviarla per il sequenziamento del DNA (vedi Tabella dei materiali).
3. Analizza i dati della sequenza di DNA per confrontare le sequenze di DNA attese e osservate utilizzando un software di analisi della sequenza del DNA per garantire che non vi siano mutazioni e che i geni siano stati inseriti correttamente.
   NOTA: Di seguito viene presentato l'utilizzo di E. coli come sensore chimico.

6. Preparazione di colture di E. coli

1. Preparare LB con 100 μg/mL di ampicillina per colture liquide.
2. Preparare le colture liquide dei batteri del sensore, dei batteri di controllo positivo* e dei batteri di controllo negativo**.
   NOTA: *Batteri di controllo positivi: E. coli contenente un plasmide con il gene RFP sotto il controllo di un promotore costitutivo; in questo lavoro è stato utilizzato il plasmide E1010 del registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (vedi Tabella dei materiali).**Batteri di controllo negativi: E. coli contenente un plasmide con il gene RFP sotto il controllo di un promotore diverso, come il promotore pBad (plasmide J10060 dal registro delle parti biologiche standard utilizzate per la biologia sintetica (vedi Tabella dei materiali) o un plasmide che non ha il gene RFP.
3. Porre le colture in un'incubatrice vibrante a 37 °C e 220 giri/min per un minimo di 8 ore, massimo di 18 ore. Il brodo torbido indica la crescita batterica.

7. Titolazione di E. coli per verificare il funzionamento del dispositivo

NOTA: Una volta che i sensori sono stati titolati per verificarne il funzionamento, non è necessario ripetere questo passaggio. Un controllo positivo sotto forma di aggiunta di piombo, antimonio e 2,4-DNT o 1,3-dinitrobenzene (1,3-DNB) può verificare il funzionamento dei dispositivi per ogni utilizzo senza la necessità di una titolazione completa.

1. Preparare una soluzione madre dell'analita o degli analiti di interesse a una concentrazione di 10 ppm in acqua. Se la solubilità è un problema, utilizzare una miscela 50/50 di acqua/metanolo.
2. Utilizzando la Tabella 4 come guida, etichettare il numero appropriato di provette di coltura sterili e inserire 2 mL di brodo coltivato (dalla fase 6 del protocollo) in ciascuna provetta.
   NOTA: Per determinare un intervallo analitico generale, eseguire almeno tre diversi livelli di analita con i batteri del sensore, un livello con il controllo negativo e un livello con il controllo positivo. Dovrebbe esserci anche un tubo di ciascuno dei batteri che non ha aggiunto metallo (un altro tipo di controllo negativo). Per determinare in modo più accurato l'intervallo analitico e i limiti di rilevamento, utilizzare un intervallo più ampio di concentrazioni di analiti.
3. Aggiungere la soluzione madre dell'analita alle provette contenenti 2 mL di brodo come indicato nella Tabella 4, posizionare i tappi a scatto sulla provetta di coltura in modo che siano allentati (per consentire il flusso d'aria nella provetta) e agitare la provetta di coltura.
4. Lasciare i tappi a scatto sulle provette di coltura e metterli in un'incubatrice agitata a 220 giri/min e 37 °C per almeno 24 ore.
5. Rimuovere le provette dall'incubatore, far scattare saldamente i tappi sulle provette e conservare le provette in frigorifero fino al momento dell'analisi della fluorescenza.

8. Utilizzo di E. coli come sensore chimico per residui di proiettili da arma da fuoco (GSR)

1. Utilizzando una salvietta a base di etanolo progettata per rimuovere il piombo (vedere la Tabella dei materiali), strofinare tutte le superfici delle mani, anche tra le dita. Usa una salvietta separata per ogni mano. Conservare le salviette in un sacchetto sigillabile adeguatamente etichettato fino all'analisi.
2. Per le superfici da testare, utilizzare una salvietta a base di alcol per grandi superfici o un batuffolo di cotone inumidito con etanolo per piccole superfici.
   NOTA: Per dimostrare la risposta dei sensori al GSR, l'interno di un bossolo di cartuccia calibro .40 esaurito è stato tamponato con un batuffolo di cotone inumidito con etanolo.
3. Indossando guanti puliti e utilizzando forbici pulite con alcool, tagliare una sezione di circa 1 cm² dal centro della salvietta.
4. Posizionare il pezzo tagliato della salvietta per le mani o il batuffolo di cotone direttamente in una provetta di coltura che contenga 2 ml di batteri del sensore, assicurandosi che sia immerso nel brodo.
5. Procedere come descritto sopra nei passaggi 7.4 – 7.5.

Tabella 1. Miscela di reazione per la legatura, fase del protocollo 3.1.1.

COMPONENTE	20 μl DI REAZIONE
10X tampone DNA ligasi T4	2 μl
DNA plasmidico (3 kb)	3 μl
DNA del promotore (0.7kb)	10 μl
Acqua priva di nucleasi	4 μl
T4 DNA ligasi	1 μl

 

 

 

 

 

 

Tabella 2. Miscele di reazione per la PCR delle colonie, fase 4.1 del protocollo.

Componente	Reazione da 25 μl
Primer in avanti da 10 μM	0,5 μl
Primer inverso da 10 μM	0,5 μl
UnTaq 2X Master Mix	12,5 μl
Acqua priva di nucleasi	11 μl

 

 

 

 

 

Tabella 3. Parametri di termociclo PCR per la fase 4.3 del protocollo.

PASSO	TEMP	ORE
Denaturazione iniziale	94 °C	30 secondi
30 cicli	94 °C	30 secondi
	55 °C	45 secondi
	68 °C	Anni '60
Estensione finale	68 °C	5 minuti
Tenere	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

Tabella 4. Esperimento generale impostato per la titolazione di biosensori, fase 7.2 del protocollo.

ID tubo	Batteri	Concentrazione della soluzione di analita aggiunta (ppm)	Metallo aggiunto	Volume di soluzione analitica aggiunto a 2.000 μl di brodo	[analita], ppb
1	PbRFP	10	Pb	2.5	12
2	PbRFP	10	Pb	75	361
3	PbRFP	10	Pb	150	698
4	PbRFP	0	nessuno	0	0
5	RFP neg	10	Pb	10	50
6	Pos RFP	10	Pb	10	50

Materiali