Saggio di sciamatura per la visualizzazione della motilità della superficie batterica

Abstract

Fonte: Morales-Soto, N. et. al., Preparazione, imaging e quantificazione dei saggi di motilità della superficie batterica. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra un test di sciamatura utilizzando batteri che esprimono la proteina fluorescente verde per osservare la motilità superficiale sull'agar molle. L'imaging time-lapse cattura l'espansione coordinata e la formazione dei viticci, evidenziando la motilità della superficie batterica.

Protocollo

1. Preparazione e inoculazione dei terreni di saggio a sciame

1. Preparazione dei terreni
   NOTA: La composizione del mezzo descritta di seguito è applicabile agli studi sulla formazione di viticci di Pseudomonas aeruginosa . Si prega di consultare le specifiche dei terreni nella Tabella 1 per i saggi di motilità superficiale di Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Myxococcus xanthus .
   1. Miscelare 200 ml di terreno a sciame fluido di bioreattore aerobico (FAB) meno solfato di ammonio ((NH4)₂SO₄) (Tabella dei materiali), 0,9 g di agar nobile e 0,2 g di casamino acidi (Tabella 1) agitando con un'ancoretta magnetica. Utilizzare piccoli volumi (100-300 ml) per migliorare la coerenza tra gli esperimenti.
   2. Sterilizzare in autoclave la miscela agar/terreno di coltura da 200 ml utilizzando un tempo di esposizione di 22 minuti, una temperatura di esposizione di 121,1 °C e un'opzione di sfiato rapido. Le impostazioni dell'autoclave consentiranno una corretta sterilizzazione e fusione dell'agar, ma impediranno la caramellizzazione dell'agar.
      NOTA: L'agar nobile è soggetto a caramellizzazione; La motilità batterica è alterata sull'agar caramellato.
   3. Immediatamente dopo la conclusione del ciclo di sterilizzazione, chiudere il tappo del flacone del terreno per evitare la perdita d'acqua per evaporazione. Tuttavia, tieni presente che la tappatura ermetica può causare un effetto simile alla "sigillatura sottovuoto" sulla bottiglia.
   4. Raffreddare il terreno a 50 °C mescolando a temperatura ambiente (RT) e aggiungere 2 ml di glucosio sterile 1,2 M. In alternativa, posizionare il fluido in un'incubatrice a 60 °C o in un bagnomaria fino al momento dell'uso (fino a 15 ore dopo) e procedere come indicato. Per evitare la formazione di bolle nel fluido, mescolare accuratamente utilizzando l'ancoretta magnetica; Le bolle sulla superficie dell'agar impediranno anche la sciamatura.
      NOTA: Per altri saggi, aggiungere componenti sensibili al calore che non possono essere sterilizzati in autoclave, come nutrienti o coloranti aggiuntivi, in questa fase, se necessario (ad esempio, 8 μl di colorante Invitrogen Syto 63 per 100 ml di agar fuso per l'immagine di M. xanthus, come mostrato nei risultati rappresentativi, di seguito). L'aggiunta di alcuni coloranti può influenzare il comportamento di sciamatura al basale, che dovrebbe essere verificato rispetto a un controllo senza coloranti.
   5. In una cappa da laboratorio, aliquotare 7,5 ml di terreno sterile per piastra di Petri in polistirene di 60 mm di diametro e mantenere le piastre in un unico strato (non impilate). Per una superficie di sciamatura più ampia, aliquotare 25 ml di terreno per piastra di Petri di 100 mm di diametro. È importante riempire i piatti su una superficie orizzontale uniforme. Usa una livella a occhio di bue per verificare se la superficie è livellata.
      NOTA: Per i saggi di P. aeruginosa , l'utilizzo di un volume specifico di terreno per piastra migliorerà la consistenza e la riproducibilità. Per i saggi di B. subtilis e M. xanthus , la colata manuale produce risultati paragonabili alle aliquote di volume specifico.
2. Indurimento delle piastre
   1. Per piastre piccole (60 mm), lasciare indurire il terreno di agar fuso (sia semisolido che asciutto del liquido in eccesso) nella cappa scoperta (cioè senza coperchi) per 30 minuti. Le piastre più grandi (100 mm) richiedono un tempo di indurimento più lungo (vedi Discussione).
      NOTA: In alternativa, alcuni saggi possono richiedere l'indurimento delle piastre sul banco di lavoro durante la notte (20-24 ore) coperte (cioè con i coperchi) in un unico strato (Tabella 1). La sciamatura è sensibile sia all'eccesso che all'umidità inadeguata. L'umidità, il flusso d'aria e la temperatura di un determinato laboratorio possono richiedere variazioni nella polimerizzazione delle piastre per promuovere una sciamatura ottimale del batterio.
   2. Inoculare le piastre subito dopo la fine del periodo di essiccazione. Non conservare le piastre per un ulteriore utilizzo.
      1. Eseguire il "test di diffusione dell'inchiostro" individuando una lastra di prova con una miscela di 10 μl di inchiostro nero Higgins impermeabile allo 0,50% (vol/vol) e inoculo batterico. Se la miscela inchiostro/inoculo si diffonde facilmente (cioè non mantiene la forma di goccioline) sulla superficie del supporto, il supporto avrà bisogno di più tempo per asciugarsi.
         NOTA: Per le specie particolarmente sensibili all'umidità (ad esempio, P. aeruginosa), eseguire un rapido "test di diffusione dell'inchiostro" per determinare se le lastre sono sufficientemente asciutte.
3. Inoculazione del saggio a sciame
   1. Inoculare 6 ml di terreno di coltura in brodo (vedere la Tabella 1 per i dettagli) con una colonia isolata da una coltura su piastra di brodo di lisogenesi (LB) fresca (< 5 giorni se lasciata a temperatura ambiente). Incubare le colture di brodo per una notte (≤18 ore) a 30 °C o 37 °C con agitazione orizzontale (240 giri/min).
   2. Inoculare le piastre dello sciame con 1-5 μl di coltura in brodo durante la notte o "colpendo" l'agar con uno stuzzicadenti sterile o un ago da inoculazione a filo.
      NOTA: Preferiamo quest'ultimo metodo perché riduce la probabilità di schizzi nell'inoculo e impedisce l'aggiunta di ulteriore umidità alla superficie dello sciame.
4. Incubazione del saggio a sciame
   1. Per un saggio generale, incubare le piastre del saggio a sciame a 30 °C o 37 °C (o anche a 42 °C per B. subtilis; Tabella 1): questo è specifico del batterio. Capovolgere le piastre durante l'incubazione in modo che l'umidità in eccesso si condensi sul coperchio, non sull'agar.
      NOTA: La temperatura può influenzare il fenotipo e la cinetica. Per gli sciami di P. aeruginosa , l'incubazione a 37 °C porta a una crescita e a un'espansione dello sciame più rapide rispetto all'incubazione a 30 °C; Tuttavia, la morfologia di questi sciami spesso differisce con questo cambiamento di temperatura.
   2. Per l'imaging time-lapse, incubare le piastre dello sciame alla temperatura appropriata prima di trasferirle alla stazione di imaging (vedere la Tabella 1 per i dettagli).
      NOTA: Questa incubazione pre-imaging consente agli sciami di iniziare il loro sviluppo e stabilirsi prima di essere spostati in un nuovo ambiente, che può essere o meno ottimale per la motilità dello sciame.

2. Imaging macroscopico di saggi di motilità superficiale

1. Per l'imaging time-lapse, dopo il periodo di incubazione pre-imaging, posizionare le piastre del saggio dello sciame su una piastra di imaging trasparente all'interno di una stazione di imaging commerciale in vivo . Immagini fino a sei lastre di 60 mm di diametro o quattro lastre di 100 mm di diametro alla volta. Poiché la fotocamera acquisisce le immagini da sotto il piano di imaging, invertire le lastre in modo che il percorso ottico non sia ostruito. In alternativa, incubare a 30 °C o 37 °C (Tabella 1) per tutta la durata dell'esperimento e rimuovere le piastre da visualizzare dall'incubatore a intervalli di tempo prestabiliti.
2. Posizionare i coperchi delle piastre di Petri in posizione verticale sopra la controparte della piastra che contiene il terreno inoculato. Riempi i coperchi delle piastre di Petri con acqua per evitare un'eccessiva essiccazione durante l'imaging e racchiudi l'intera configurazione utilizzando un altro vassoio trasparente per mantenere l'umidità durante l'esperimento.
3. Utilizzando il software di imaging molecolare (MI), eseguire i saggi a temperatura ambiente utilizzando le impostazioni di imaging descritte nella Tabella 2. Per l'imaging time-lapse, impostare un protocollo con i passaggi e le specifiche necessari.

Tabella 1: Specifiche per la preparazione del saggio di motilità superficiale. Include le specifiche di preparazione dei saggi di motilità superficiale per P. aeruginosa, B. subtilis e M. xanthus.

	P. aeruginosa	Studi sulla formazione di viticci di P. aeruginosa	B. subtilis	M. xanthus
Terreni di coltura in brodo durante la notte	FAB più 30 mM di glucosio	FAB più 30 mM di glucosio	LB	CTT (mezzi complessi)
Temperatura di incubazione della coltura del brodo durante la notte	37 °C	37 °C	37 °C	30 ore a 30 °C
Swarm media	FAVOLOSO	FAB meno (NH4)2SO4	2% (peso/vol) LB	CTT
Swarm media: componenti aggiuntivi	12 mM di glucosioa	10% (in peso/vol) di casamminoacidi (CAA), 12 mM di glucosioa	n/a	SYTO® 64a
Tipo di agar	Agar, Nobile	Agar, Nobile	Agari granulari	Agar, Nobile Affymetrix
Concentrazione di agar (wt/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
Dimensioni della piastra dello sciame	60 millimetri	60 millimetri	100 millimetri	150 millimetri
Volume del supporto per lastra	Confezione da 7,5 ml	Confezione da 7,5 ml	Versato a mano	Versato a mano
Metodo di impostazione/asciugatura dei supporti a sciame	Cappuccio; piatti scoperti	Cappuccio; piatti scoperti	Piastre da banco rivestite	Piastre da banco rivestite
Impostazione del supporto a sciame/tempo di asciugatura	30 minuti	30 minuti	Pernottamento (20 -24 ore)	Pernottamento (20 -24 ore)
Temperatura di incubazione del saggio a sciame	30 o 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
Incubazione per l'imaging time-lapse	30 °C per almeno 4 ore	30 °C per almeno 4 ore	37 °C per 2 ore	RT per 12 ore
Lunghezza dell'acquisizione time-lapse	24 ore su 24	24 ore su 24	10 ore	66 ore
Impostazione time-lapse	1 fotogramma/10 min	1 fotogramma/10 min	1 fotogramma/6 min	1 fotogramma/10 min
a Aggiunto dopo la sterilizzazione in autoclave.

 

Tabella 2: Specifiche di imaging. Specifiche della stazione di imaging Bruker per l'imaging a fluorescenza e luminescenza rossa e verde della crescita batterica superficiale.

Segnale	Fluorescenza verde	Fluorescenza rossa I	Fluorescenza rossa II	Luminescenza
Proteine o coloranti	Proteina fluorescente verde (GFP)	mProteina ciliegia o colorazione ramnolipidica rosso del Nilo	SYTO® 64	Luciferasi dall'operone di lux
Lunghezza d'onda di eccitazione (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Spento
Lunghezza d'onda di emissione (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Nessun filtro
Tempo di esposizione (sec)	30	60	60	240
f-stop	4.0	4.0	2.5	1.1
Campo visivo (mm)	190	190	140	120
Piano focale (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Binning (pixel)	Nessuno	2 x 2	Nessuno	8 x 8

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti:
Supporti minimi FAB:				Preparare ogni ~4 settimane. Completare a 1 L con nanopure H2O.
(NH4)numero araboSO4	Sigma	Codice: A4418	2 g	Non utilizzato negli studi sulla formazione di viticci di P. aeruginosa .
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	P5655	3 g
NaCl	BDH	BDH8014	3 g
Soluzione di MgCl2 x 6H2O (198 g/L)	Fisher Scientifico	M33	1 ml
CaCl2 x 2H2O soluzione (14 g/L)	Fisher Scientifico	C79	1 ml
Soluzione di tracce metalliche (vedi sotto)	n/a	n/a	1 ml
Soluzione di tracce metalliche:				Portare a 1 L con nanopure H2O. Conservare in una bottiglia di vetro, mescolando e coprendo con un foglio.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientifico	C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Codice: C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientifico	Visualizzazione della serie A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
Supporti CTT:				Prepara secondo necessità. Portare a 100 ml con nanopure H2O.
Tris-HCl, soluzione 1 M (regolare a pH 8,0)	Amresco	234	1 ml	Preparare una soluzione madre 1 M in nano puro H2O. Regolare il pH a 8,0 e sterilizzare con il filtro (poro da 0,2 μm).
K2HPO4, 1 soluzione M (regolare a pH 7,6)	Sigma-Aldrich	P3786	Flacone da 0,1 ml	Preparare una soluzione madre 1 M in nano puro H2O. Regolare il pH a 7,6 e sterilizzare con il filtro (poro da 0,2 μm).
Soluzione di MgSO4	Fisher Scientifico	M65	Flacone da 0,8 ml	Preparare una soluzione madre 1 M in nano puro H2O. Sterilizzare il filtro (poro 0,2 μm).
Casitone	Diagnostica BD	225930	1 g
Reagenti aggiuntivi:
LB Brodo, Lennox	Diagnostica BD	240230	2 % (peso/vol)
D-(+)-glucosio	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM per le colture in brodo notturne; 12 mM per i fluidi swarm	Preparare una soluzione madre sterilizzata con filtro da 1,2 M in nano puro H2O. Aggiungere al terreno dopo la sterilizzazione in autoclave.
Casamminoacidi (CAA)	Amresco	J851	0,10 % (peso/vol)	Consigliato per studi di formazione di viticci di P. aeruginosa . Aggiungere ai supporti prima della sterilizzazione in autoclave.
Agar, Nobile	Sigma-Aldrich	Codice: A5431	0,45 % (peso/vol)	Preferito l'agar nobile per gli studi di motilità superficiale di P. aeruginosa . Aggiungere ai supporti prima della sterilizzazione in autoclave.
Agar, Nobile	Affymetrix	10907	1,50 % (peso/vol)	Utilizzato negli studi di motilità superficiale di M. xanthus. Non raccomandato per gli studi sulla motilità di P. aeruginosa . Aggiungere ai supporti prima della sterilizzazione in autoclave.
Agar, granulato	Fisher Scientifico	BP1423	0,60 % (peso/vol)
Inchiostro di china nero impermeabile Higgins	Higgins	HIG44201	0,50 % (vol/vol)	Mescolare l'inchiostro con l'inoculo per testare l'umidità della superficie del supporto a sciame.
SYTO® 64 colorante di acido nucleico fluorescente rosso	Invitrogen	S-11346		Utilizzare 4 μl (per P. aeruginosa) o 8 μl (per M. xanthus) di SYTO® 64 per 100 ml di agar fuso (aggiunto dopo la sterilizzazione in autoclave).
Materiali e attrezzature pertinenti:
Piastra di Petri, sterile, 150 mm x 15 mm (Ø x A)	VWR	25384-326
Piastra di Petri, sterile, 100 mm x 15 mm (Ø x A)	VWR	25384-342
Piastra di Petri, sterile, 60 mm x 15 mm (Ø x A)	VWR	25384-092
Xtream in vivo	Bruker			Utilizzare per l'imaging macroscopico di studi di motilità superficiale. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html