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1. Preparare strumenti, terreni di coltura, soluzioni e piastre di Petri
1. Autoclavare gli stuzzicadenti in un becher da 50 ml coperto con un foglio di alluminio per mantenerli sterili.
2. Sterilizzare tutti i prodotti secchi che verranno utilizzati (punte, bastoncini, vetreria, ecc.) in autoclave.
NOTA: Cautela! Seguire tutte le indicazioni di sicurezza per il modello di autoclave utilizzato. Le autoclavi rappresentano un rischio di esplosioni, ustioni da vapore e contatto con superfici, materiali e fluidi caldi.
3. Preparare l'agar MS (farina di soia mannitolo (SFM)) per coltivare le colture.
1. Aggiungere 5 g di farina di soia e 5 g di agar agar in un pallone da 1 litro.
2. Sciogliere 5 g di mannitolo in 250 ml di acqua di rubinetto e versare nel pallone contenente la farina di soia e l'agar.
3. Aggiungere un tappo di schiuma e un foglio di alluminio all'apertura del pallone e sterilizzare in autoclave a 121 °C, 15 psi per almeno 30 minuti.
CAUTELA: Questo mezzo bolle facilmente. Utilizzare un pallone in grado di contenere almeno quattro volte il volume effettivo di agar MS da sterilizzare in autoclave. Una pentola a pressione standard può essere utilizzata al posto di un'autoclave con considerazioni di sicurezza simili. In alternativa, è possibile utilizzare un forno a microonde per sterilizzare terreni e materiali se non è possibile accedere a un'autoclave. Gli insegnanti delle scuole superiori potrebbero anche voler collaborare con i college o le università locali per accedere alle forniture autoclavate.
4. Raffreddare i supporti fino a quando non sono abbastanza comodi da maneggiare. Fare attenzione a non raffreddarlo troppo a lungo perché l'agar si solidifica a temperature inferiori a 50 °C.
5. Versare l'agar MS dal pallone in piastre di Petri sterili fino a quando il fondo di ciascuna piastra di Petri non è pieno per circa metà (circa 25 ml di terreno per piastra di Petri). Lasciare solidificare prima di utilizzare le piastre di agar. Conservare le piastre di agar in un sacchetto di plastica a temperatura ambiente fino al momento del bisogno.
NOTA: Le piastre di agar possono anche essere conservate in frigorifero, soprattutto se sono necessari antibiotici nel terreno.
2. Striare gli streptomiceti sulle placche per la propagazione
1. Streak Streptomyces ceppa su piastre di agar MS su singole colonie utilizzando un metodo standard, come il metodo della striscia a quadranti.
NOTA: È possibile utilizzare un'ansa di inoculazione o stuzzicadenti sterili. Facoltativo: altri terreni sono comunemente usati per le specie di Streptomyces , come R2YE e terreni minimi.
2. Incubare le piastre a 30 °C.
3. Ristreggiare le piastre raccogliendo una singola colonia ogni 4-6 giorni. Man mano che le colonie invecchiano, diventano inclini a mutazioni casuali.
3. Confronta e registra l'aspetto visivo
1. Prendere nota della morfologia della colonia per ogni mutante rispetto al ceppo genitore wild-type dopo aver striato tutti i ceppi come nel passaggio 2. Confrontate il nuovo isolato con quello di una specie ben studiata, come S. coelicolor o S. venezuelae, quando si caratterizzano le nuove specie di Streptomyces . Si notino le caratteristiche (Figura 1) come la forma di base, la superficie della colonia (sfocata, calva, rugosa, ecc.), l'opacità, l'elevazione e la pigmentazione (distinguere tra micelio vegetativo, micelio aereo e/o mezzo circostante).
2. Etichettare una piastra di agar MS e striare i ceppi wild-type e mutanti in modelli a cuneo (Figura 1). Fare attenzione che nessun ceppo tocchi un altro ceppo per evitare la contaminazione incrociata. Notare la data e l'ora in cui le varietà sono striate sul piatto. Incubare le piastre a 30 °C.
3. Posizionare le piastre di Petri coltivate su carta colorata o bianca per omogeneizzare lo sfondo. Scrivi sul foglio il nome del ceppo, la data, la temperatura di incubazione e il tempo dalla prima striatura della piastra. Scatta una foto digitale della lastra con queste ultime informazioni scritte sullo sfondo cartaceo in modo da ridurre al minimo la confusione.
NOTA: La scritta può essere ritagliata dalla fotografia in un secondo momento se deve essere utilizzata per la preparazione della figura.
