Microscopia a contrasto di fase per la valutazione dei mutanti dello sviluppo negli streptomiceti

Abstract

Fonte: Bennett, J. A. et al. Valutazione visiva e microscopica dei mutanti dello sviluppo di Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra l'uso della microscopia a contrasto di fase per esaminare le differenze fenotipiche tra Streptomyces coelicolor wild-type e mutante. Delinea le fasi coinvolte nella preparazione e nell'imaging dei filamenti aerei per rilevare i difetti di sviluppo nella formazione delle spore.

Protocol

1. Eseguire la microscopia a contrasto di fase

1. Sterilizzare le pinzette lavandole con etanolo al 70% e poi passandole attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen per far evaporare l'etanolo. Lasciar raffreddare.
2. Sterilizzare i vetrini coprioggetti lavandoli in etanolo al 70% e lasciandoli asciugare in una capsula di Petri sterile.
3. Preparare un vetrino coprioggetti della crescita batterica da esaminare.
   1. Prendere un vetrino coprioggetti sterile con una pinzetta sterile e posizionare il vetrino coprioggetti su una piastra di agar di farina di soia di mannitolo (MS) dove la crescita batterica dello Streptomyces coelicolor è densa. Premere delicatamente sul retro del vetrino coprioggetto con una pinzetta per garantire un trasferimento sufficiente delle spore batteriche e del micelio aereo.
4. Raccogliere il vetrino coprioggetti dalla piastra e posizionarlo in modo che il lato con il materiale cellulare sia rivolto verso la superficie di un vetrino da microscopio, con una goccia da 15 μl di glicerolo al 50% preparata in acqua per il montaggio. Ridurre le bolle d'aria posizionando il vetrino coprioggetti con un angolo di 45° rispetto al vetrino e lasciandolo cadere sul glicerolo al 50%.
5. (Facoltativo) Sigillare con smalto trasparente per preservare il vetrino.
6. Eseguire la microscopia a contrasto di fase a vari intervalli di tempo durante i cicli di vita.
   NOTA: L'imaging ripetuto consente un'analisi più completa e la capacità di rilevare ritardi nello sviluppo. Ripeti le osservazioni in modo indipendente per garantire accuratezza e riproducibilità.
   1. Posizionare il vetrino preparato sul tavolino del microscopio e aggiungere una goccia di olio da immersione al centro del vetrino coprioggetti. Ruotare l'obiettivo di fase 100X in posizione e impostare la torretta del condensatore sull'impostazione corretta della fase "corrispondente". Mettere a fuoco l'immagine utilizzando solo la manopola di regolazione fine una volta che la lente dell'obiettivo è a contatto con l'olio.
   2. Esaminare diversi campi visivi per discernere differenze evidenti e coerenti tra i ceppi mutanti e il tipo selvatico, come la capacità di formare spore, le dimensioni e la forma delle spore e il numero complessivo di spore (vedi Figura 1).
      NOTA: Le alternative alla microscopia a contrasto di fase includono la microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC) e semplici tecniche di colorazione per l'uso con microscopi a campo chiaro, come la colorazione cristallovioletta.

Results

Figura 1: Micrografie a contrasto di fase che mostrano un filamento aereo rappresentativo per ceppi mutanti bianchi di Streptomyces coelicolor contenenti mutazioni casuali di inserzione dei trasposoni. ...

Materials