Stabilire una coltura binaria di saccaribatteri con batteri ospiti

Abstract

Fonte: Collins, A. J., et al., Stabilire colture binarie stabili di saccaribatteri simbiotici dalla cavità orale. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra la creazione e il mantenimento di una coltura binaria di Saccharibacteria e del suo batterio ospite co-incubandoli in sequenza in un terreno di crescita specifico per l'ospite.

Protocollo

1. Concentrato di cellule di saccaribatteri mediante centrifugazione
   1. Fare un segno di orientamento sulla provetta e sul tappo e posizionare la provetta in una centrifuga ad alta velocità con il segno sul lato superiore. Il pellet formato dalla centrifugazione è solitamente invisibile. La marcatura aiuterà a determinare dove si trova il pellet di cellule di Saccharibacteria quando la centrifugazione è terminata e la provetta viene rimossa dalla centrifuga.
   2. Centrifugare i campioni a 60.000 x g per 1 ora a 4 °C.
      NOTA: Questa forza e questo tempo sono sufficienti per pellettare tutte le cellule di Saccharibacteria. Tuttavia, le cellule di Saccharibacteria possono essere pellettate almeno parzialmente mediante centrifugazione per un minimo di 20 minuti a 20.000 x g.
   3. Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga. Versare il liquido dal tubo, mantenendo il pellet sul lato superiore del tubo.
   4. Risospendere il pellet, solitamente invisibile, in 1-2 mL di tampone MRD (Maximal Recovery Diluent) mediante vortice vigoroso.

2. Infettare le colture ospiti con filtrato arricchito con Saccharibacteria

1. Preparare le provette di coltura aliquotando 2 ml di terreno di coltura appropriato (ad es. TSBY (brodo di soia triptico con estratto di lievito allo 0,1%), BHI (Brain Heart Infusion), ecc.) in provette.
2. Aggiungere 200 μl della coltura notturna di organismi ospiti in ciascuna provetta. Aggiungere 100-200 μl di campione filtrato risospeso a ciascuna provetta.
3. Incubare campioni combinati in base all'organismo ospite (ad esempio, 37 °C, in atmosfera aerobica per Arachnia propionica).
4. Far passare le cellule ogni due o tre giorni trasferendo 200 μL di coltura binaria a 2 mL di terreno di crescita fresco in una nuova provetta. Se sembra che le colture passate non mostrino alcuna crescita (cioè, la torbidità/densità ottica della coltura non aumenta dopo il passaggio in terreni freschi), i Saccharibacteria potrebbero travolgere o uccidere tutti gli organismi ospiti. Per rimediare a ciò, aggiungere 200 μL di coltura ospite non infetta durante il passaggio delle cellule. Ripetere per almeno 5 passaggi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Brodo per infusione di cuore cerebrale (polvere disidratata)	Becton-Dickinson	211059	O altri mezzi di crescita adatti agli organismi bersaglio
Rotore per centrifuga 70-Ti	Beckman Coulter	337922
2 Scatola a guanti InVitro Control	Timidi Laoratori	31615	Se necessario per organismi microaerobi
Centrifuga ad alta velocità Optima L-100 XP	Beckman Coulter	8043-30-1124
Micropipetta P-1000	Gilson	F123601G
Micropipetta P-200	Gilson	F123602G
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Fisher Scientifico	BP399500
Peptone	Fisher Scientifico	BP1420-500
Puntali per pipette - 1000 μl	Fisher Scientifico	02-717-166
Puntali per pipette - 200 μl	Fisher Scientifico	02-717-165
Provette da centrifuga coniche con tappo a vite 15 mL	Falcone	352096	O altra provetta adatta per la coltura batterica
Provette per centrifuga in policarbonato a parete spessa 25 x 89 mm (capacità 26,3 ml) con tappi	Beckman Coulter	355618
Piastre di agar sangue di soia trittica	Servizi di laboratorio del nord-est	P1100	O altra piastra di agar sufficiente per la crescita di organismi ospiti
Brodo di Soia Triptico (polvere disidratata)	Becton-Dickinson	211825	O altri mezzi di crescita adatti agli organismi bersaglio
Estratto di lievito	Fisher Scientifico	BP1422-500