Subcoltura di batteri anaerobi solfito-riduttori da una coltura di agar

Abstract

Fonte: Anwar, Z., et al. Arricchimento e rilevamento di tossinotipi di Clostridium perfringens in campioni di alimenti al dettaglio. J. Vis. Exp. (2019).

In questo video, i batteri che riducono i solfiti vengono coltivati in un terreno di agar contenente solfito, dove crescono anaerobicamente e riducono il solfito a idrogeno solforato, formando precipitati neri con ioni ferro. Le colonie nere vengono isolate dalla profondità dell'agar utilizzando tecniche asettiche e trasferite in terreno fresco per un'incubazione anaerobica continua.

Protocollo

NOTA: Il Clostridium perfringens è considerato un organismo di livello 2 di rischio per la biosicurezza (BSL2). Sebbene non tutti i campioni alimentari contengano C. perfringens, tutti i campioni coltivati devono essere trattati come tali. Tutte le precauzioni adeguate e i dispositivi di protezione personale (DPI) devono essere indossati in ogni momento. Decontaminare tutto il materiale prima dello smaltimento.

1. Preparare l'RPM modificato (Rapid perfringens medium)

1. Unire 30 g/L di terreno fluido tioglicolato, 60 g/L di gelatina, 5 g/L di peptone, 5 g/L di glucosio, 5 g/L di fosfato di potassio bibasico, 3 g/L di estratto di lievito, 1,5 g/....

Risultati

Figura 1: Schema della tecnica del sandwich di agar TSC.

I terreni RPM contenenti i batteri C. perfringens vengono placcati tra due strati di agar TSC per promuovere un ambiente anaerobico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
D-Cicloserina	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C6880
Destrosio	Sigma Scienze della Vita	D9434-250G
Pipette di trasferimento monouso	qualsiasi marca		Selezionane uno con punta sottile come le pipette di trasferimento monouso Thermo Scientific 137116M/EMD
Kit per sangue e tessuti DNeasy	Qiagen	69504	Nota: sono stati valutati numerosi kit per l'estrazione di DNA e plasmidi, questo kit ha dato i risultati più desiderabili.
Incubatrice a secco	qualsiasi marca
Mezzo fluido tioglicolato	Remel	R453452
Gelatina dalla pelle suina	Sigma Scienze della Vita	G1890-500G
Solfato di ferro (II) eptaidrato	Sigma Scienze della Vita	F8633-250 G
Lisozima da albume d'uovo di gallina	Sigma-Aldrich	L6876	Necessario per l'estrazione del DNA, non fornito nel kit
Parafilm o involucro di plastica	qualsiasi marca
Peptone da caseina e altre proteine animali	Sigma-Aldrich	70173-100G
Perfringens Agar Base (TSC + SFP)	Ossoide	CM0587	Prepara l'agar TSC secondo le istruzioni
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	P2222-100G
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S-7653
Raschietto per cellule sterili	qualsiasi marca
Divaricatore di cellule sterili	qualsiasi marca
Piastre di Petri sterili	qualsiasi marca
Estratto di lievito	Sigma-Aldrich	70161-100G