Subcoltura di batteri anaerobi solfito-riduttori da una coltura di agar

Abstract

Fonte: Anwar, Z., et al. Arricchimento e rilevamento di tossinotipi di Clostridium perfringens in campioni di alimenti al dettaglio. J. Vis. Exp. (2019).

In questo video, i batteri che riducono i solfiti vengono coltivati in un terreno di agar contenente solfito, dove crescono anaerobicamente e riducono il solfito a idrogeno solforato, formando precipitati neri con ioni ferro. Le colonie nere vengono isolate dalla profondità dell'agar utilizzando tecniche asettiche e trasferite in terreno fresco per un'incubazione anaerobica continua.

Protocollo

NOTA: Il Clostridium perfringens è considerato un organismo di livello 2 di rischio per la biosicurezza (BSL2). Sebbene non tutti i campioni alimentari contengano C. perfringens, tutti i campioni coltivati devono essere trattati come tali. Tutte le precauzioni adeguate e i dispositivi di protezione personale (DPI) devono essere indossati in ogni momento. Decontaminare tutto il materiale prima dello smaltimento.

1. Preparare l'RPM modificato (Rapid perfringens medium)

1. Unire 30 g/L di terreno fluido tioglicolato, 60 g/L di gelatina, 5 g/L di peptone, 5 g/L di glucosio, 5 g/L di fosfato di potassio bibasico, 3 g/L di estratto di lievito, 1,5 g/L di cloruro di sodio, 0,5 g/L di solfato ferroso in acqua deionizzata fino a dispersione uniforme. In genere produciamo lotti da 1 L.
2. Autoclavare a 121 °C per 15 min.
3. Lasciar raffreddare a circa 40 °C.
4. Una volta che l'RPM si è raffreddato, aggiungere la D-cicloserina a una concentrazione finale di 440 mg/L.
   NOTA: Le concentrazioni stock di D-cicloserina disciolta in acqua sterile a 50 mg/mL possono essere conservate a -20 °C per un uso futuro.
5. Trasferire asetticamente 10 mL di RPM in provette coniche da 15 mL. Gli RPM possono essere preparati in lotti e conservati a 4 °C per un massimo di un mese.
6. Caldo RPM a 37 °C prima dell'uso.

2. Raccolta dei campioni e incubazione RPM

1. Trasportare gli alimenti in laboratorio a temperatura ambiente entro 1 ora. Gli alimenti possono essere trasportati nell'imballaggio originale o in contenitori sterili. Se non viene testato immediatamente, il cibo può essere conservato a -20 °C fino al momento dell'uso. Se disponibile, annotare il tipo di alimento e il paese di origine in base all'etichetta della confezione, nonché qualsiasi altra informazione pertinente.
2. Rimuovere circa 1,0-2,0 g di cibo e trasferirlo in una capsula di Petri sterile o equivalente. Tritare finemente con una lama di rasoio sterile o un bisturi.
3. Inoculare in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in una provetta conica da 15 mL. Mescola bene.
   1. Per selezionare le cellule vegetative, trasferire 5 mL della miscela di alimenti PBS in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di RPM. Chiudi bene il coperchio.
   2. Per selezionare le spore, riscaldare i restanti 5 mL di miscela di alimenti PBS a 85 °C per 15 minuti e quindi trasferirli in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di RPM. Chiudi bene il coperchio.
4. Agitare e invertire le colture RPM del cibo per garantire una miscelazione completa.
5. Sigillare ermeticamente le provette coniche e avvolgere i coperchi con pellicola di paraffina o pellicola trasparente per garantire un ambiente anaerobico.
6. Incubare per una notte (ON) a 37 °C.
7. La mattina seguente, annotare eventuali torbidità o fermentazioni in tubi RPM.

3. Placcatura "a sandwich" TSC (triptosio solfito cicloserina)

1. Inoculare le colture ON RPM nell'agar TSC utilizzando una tecnica "a sandwich" (Figura 1) descritta di seguito.
2. Preparare l'agar TSC secondo le istruzioni del produttore.
   1. Preparare lo strato di base delle piastre TSC trasferendo 10 mL di agar TSC fuso in piastre di Petri sterili e lasciare solidificare. Questi possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 °C. Assicurarsi che le piastre siano riscaldate a temperatura ambiente prima dell'uso.
   2. Per lo strato superiore della piastra TSC, mantenere l'agar TSC fuso rimanente a 40 °C.
      NOTA: Sebbene il punto di fusione dell'agar sia superiore a 85 °C, l'agar fuso si solidifica intorno ai 32-45 °C.
3. Recuperare con cautela le colture ON RPM e trasferire 100 μl alla base di agar TSC. A causa della fermentazione, alcune colture possono essere sotto pressione. Assicurati di indossare tutti i DPI appropriati.
4. Stendere l'inoculo RPM utilizzando perle di vetro sterilizzate o divaricatore cellulare.
5. Lasciare che RPM venga "assorbito" nell'agar TSC per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
6. Trasferire con cautela 20 mL di agar TSC fuso a 40 °C su piastra utilizzando una pipetta sierologica.
7. Riposizionare il coperchio della capsula di Petri e lasciare che l'agar TSC si solidifichi completamente a temperatura ambiente.
8. Capovolgere la capsula di Petri e incubare a 37 °C ON.
9. Se si desiderano diluizioni seriali, eseguire diluizioni delle colture ON RPM in RPM fresco e preriscaldato prima dell'inoculazione nell'agar TSC.

4. Sub-coltura di colonie solfito-riduttrici

1. La mattina seguente, rimuovere le piastre dall'incubatrice ed esaminare la crescita batterica. I batteri aerobi possono essere presenti sulla superficie dell'agar. I batteri anaerobi cresceranno incorporati all'interno dell'agar. I batteri che riducono i solfiti trasformeranno l'agar circostante in nero. Eventuali colonie di C. perfringens saranno nere e incorporate nell'agar.
2. Le colonie sospette di C. perfringens saranno positive per la riduzione dei solfiti e appariranno nere, incorporate all'interno dell'agar. Utilizzando un contagocce sterile monouso, "strappare" le colonie nere dall'agar e trasferirle a 10 ml di RPM fresco in una provetta conica da 15 ml. È importante che l'aria dal contagocce venga espulsa prima della perforazione dell'agar.
3. Se c'è una densa quantità di crescita batterica aerobica sulla superficie della piastra, utilizzare un raschietto cellulare sterile per rimuovere le colonie da aree selezionate. Più colonie sospette di C. perfringens possono essere campionate dalla stessa piastra TSC in colture RPM separate.
4. Fissare saldamente i coperchi delle provette coniche e avvolgerli in una pellicola di paraffina o in un involucro di plastica. Incubare ON a 37 °C.

Risultati

Figura 1: Schema della tecnica del sandwich di agar TSC.

I terreni RPM contenenti i batteri C. perfringens vengono placcati tra due strati di agar TSC per promuovere un ambiente anaerobico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
D-Cicloserina	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C6880
Destrosio	Sigma Scienze della Vita	D9434-250G
Pipette di trasferimento monouso	qualsiasi marca		Selezionane uno con punta sottile come le pipette di trasferimento monouso Thermo Scientific 137116M/EMD
Kit per sangue e tessuti DNeasy	Qiagen	69504	Nota: sono stati valutati numerosi kit per l'estrazione di DNA e plasmidi, questo kit ha dato i risultati più desiderabili.
Incubatrice a secco	qualsiasi marca
Mezzo fluido tioglicolato	Remel	R453452
Gelatina dalla pelle suina	Sigma Scienze della Vita	G1890-500G
Solfato di ferro (II) eptaidrato	Sigma Scienze della Vita	F8633-250 G
Lisozima da albume d'uovo di gallina	Sigma-Aldrich	L6876	Necessario per l'estrazione del DNA, non fornito nel kit
Parafilm o involucro di plastica	qualsiasi marca
Peptone da caseina e altre proteine animali	Sigma-Aldrich	70173-100G
Perfringens Agar Base (TSC + SFP)	Ossoide	CM0587	Prepara l'agar TSC secondo le istruzioni
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	P2222-100G
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S-7653
Raschietto per cellule sterili	qualsiasi marca
Divaricatore di cellule sterili	qualsiasi marca
Piastre di Petri sterili	qualsiasi marca
Estratto di lievito	Sigma-Aldrich	70161-100G