Separazione basata sulla cromatografia su strato sottile di nucleotidi (p)ppGpp isolati da batteri indotti da stress

Abstract

Fonte: Fernández-Coll, L. e Cashel, M. Utilizzo della radiomarcatura su piastra per microtitolazione per misurazioni multiple in vivo di Escherichia coli (p)ppGpp seguite da cromatografia su strato sottile. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video presenta un protocollo ad alto rendimento per misurare i livelli e la dinamica dei nucleotidi batterici di risposta allo stress ppGpp e pppGpp utilizzando la cromatografia su strato sottile (TLC). Il metodo fornisce un approccio potente, rapido ed economico per quantificare (p)ppGpp in colture batteriche in varie condizioni di stress, consentendo un'analisi ad alta risoluzione della fisiologia batterica e la risposta rigorosa.

Protocol

1. Cromatografia su strato sottile
   1. Con una matita morbida, segnare una linea di origine a 1 cm dal bordo della lastra per cromatografia su strato sottile (TLC) di 20 cm di polietilenimmina-cellulosa (PEI-cellulosa) a cui sono stati rimossi 5 cm dalla parte superiore con le forbici. Applicare 5 μl come gocciolina sulla superficie del PEI per ogni campione. Inizia lo sviluppo ascendente senza lasciare asciugare questo punto, il che migliora la risoluzione riducendo al minimo le striature.
   2. Eseguire lo sviluppo ascendente in una vasca con uno strato di soluzione da 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,4) sufficientemente s....

Results

Figura 1: Analisi TLC rappresentativa. Rappresentazione schematica dei risultati ottenuti dopo autoradiografia e screening al fosforo durante la notte con la TLC. I punti da misurare sono indicati in rosso. Viene mostrata anche la f.......

Materials