Separazione basata sulla cromatografia su strato sottile di nucleotidi (p)ppGpp isolati da batteri indotti da stress

1. Cromatografia su strato sottile
   1. Con una matita morbida, segnare una linea di origine a 1 cm dal bordo della lastra per cromatografia su strato sottile (TLC) di 20 cm di polietilenimmina-cellulosa (PEI-cellulosa) a cui sono stati rimossi 5 cm dalla parte superiore con le forbici. Applicare 5 μl come gocciolina sulla superficie del PEI per ogni campione. Inizia lo sviluppo ascendente senza lasciare asciugare questo punto, il che migliora la risoluzione riducendo al minimo le striature.
   2. Eseguire lo sviluppo ascendente in una vasca con uno strato di soluzione da 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,4) sufficientemente superficiale in modo che il liquido non tocchi il punto del campione di origine. Coprire il serbatoio con una chiusura ermetica e lasciare che il liquido risalisca fino alla parte superiore del foglio rifilato, 15 cm. Per ottenere un pH 3,4 per una soluzione 1,5 M KH₂PO₄ , è necessario regolare il pH aggiungendo H₃PO₄.
   3. Rimuovere il cromatogramma completamente sviluppato e asciugare all'aria a temperatura ambiente.
   4. Tagliare e scartare la parte superiore (fronte pH) del cromatogramma contenente il ³²P libero nei rifiuti radioattivi. Questa porzione è rappresentata in colore giallo nella Figura 1 ed è facilmente visualizzabile sotto la luce UV. Se si misurano solo nucleotidi (p)ppGpp che migrano più lentamente della guanosina trifosfato (GTP), si consiglia di eseguire uno standard GTP visibile ai raggi UV e quindi tagliare e scartare una porzione superiore più grande (qualsiasi cosa al di sopra del GTP, come mostrato nella Figura 1).
   5. Esporre le pellicole autoradiografiche durante la notte con uno schermo al fosforo.
   6. Sviluppa il film. Cattura e quantifica il segnale dello schermo al fosforo con un phosphoimager.
       
2. Quantificazione di (p)ppGpp
   1. Quantificare le macchie radioattive con l'immagine J.
      NOTA: La quantità di (p)ppGpp può essere normalizzata alla quantità totale di nucleotidi G osservati in ciascun campione (Figura 1). Se la quantità di sfondo è omogenea, è possibile sottrarre un singolo spazio vuoto (casella 4 della Figura 1) per correggere lo sfondo. Il totale G è la somma di GTP + ppGpp + pppGpp rilevati. Questa normalizzazione presuppone che i livelli di guanosina monofosfato (GMP) e guanosina difosfato (GDP) siano trascurabili, il che è vero per l'Escherichia coli. Il rapporto tra un dato nucleotide e il G totale fornisce un modo importante per correggere le variazioni nel volume del campione applicato.

Figura 1: Analisi TLC rappresentativa. Rappresentazione schematica dei risultati ottenuti dopo autoradiografia e screening al fosforo durante la notte con la TLC. I punti da misurare sono indicati in rosso. Viene mostrata anche la formula per calcolare la quantità frazionaria di ppGpp. Il totale G si riferisce alla quantità totale di GTP + ppGpp + pppGpp rilevata nel campione. La banda gialla rappresenta il fronte del pH visibile alla luce UV. Le forbici indicano dove si consiglia di tagliare il cromatogramma per scartare la maggior parte della radioattività. La freccia indica la direzione del flusso durante lo sviluppo ascendente con tampone fosfato 1,5 M