Coltura unicellulare di batteri all'interno di vescicole giganti

In questo articolo

Abstract

Fonte: Morita, M., et al. Coltura cellulare batterica a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra un metodo per la coltura e l'osservazione di singole cellule batteriche incapsulate all'interno di vescicole giganti ancorate a un doppio strato lipidico supportato. Il sistema consente l'imaging stabile e a lungo termine delle dinamiche di crescita di singole cellule in un microambiente confinato e fisiologicamente rilevante.

Protocollo

1. Preparazione di un sistema di osservazione della vescicola gigante (GV) (Bacterial Cell Culture System)

Preparazione di piccole vescicole (SV) per la costruzione di una membrana a doppio strato supportata
1. Versare 20 μl della soluzione di POPC (1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) e 4 μl della soluzione di biotina-PEG-DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000) in una provetta di vetro.
2. Evaporare il solvente organico mediante flusso d'aria per formare un film lipidico e porre questo campione in un essiccatore per 1 ora per far evaporare completamente il solvente organico.
3. Aggiungere 200 μL di glucosio 200 mM in 1x LB (brodo Luria-Bertani) di terreno (la soluzione acquosa esterna dei GV) nel flaconcino di vetro.
4. Avvolgere la parte iniziale della fiala di vetro con una pellicola e sonicarla in un bagno ad ultrasuoni (120 W) per almeno 1 ora.
5. Preparare le SV con il metodo dell'estrusione utilizzando un mini-estrusore e una membrana in policarbonato con pori di 100 nm.
Preparazione di una camera fatta a mano
1. Praticare un foro da 7 mm con un punzone cavo su una guarnizione bifacciale (10 mm x 10 mm x 1 mm).
2. Incollare la guarnizione bifacciale con il foro su un vetro di copertura (30 mm x 40 mm, spessore 0,25–0,35 mm).
Preparazione di una membrana a doppio strato supportata sul vetro di copertura nel foro della camera
1. Aggiungere 30 μl della soluzione SV nel foro della camera (preparato nella sezione 2.2) e incubare a RT per 30 minuti.
2. Lavare delicatamente il foro due volte con 20 μl di terreno da 1 LB contenente 200 mM di glucosio (la soluzione acquosa esterna dei GV) mediante pipettaggio.
Immobilizzazione dei GV sulla membrana a doppio strato supportata sul vetro di copertura nel foro della camera
1. Introdurre 10 μL di neutravidina con la soluzione acquosa esterna di GV (1 mg/mL) nel foro e incubare a RT per 15 minuti.
2. Lavare delicatamente il foro due volte con 20 μl di terreno da 1 LB contenente 200 mM di glucosio (la soluzione acquosa esterna dei GV) mediante pipettaggio.
3. Aggiungere tutta la soluzione contenente GV nel foro della camera e sigillare con un vetro di copertura (18 mm x 18 mm, spessore 0,13–0,17 mm) (Figura 1b).
Osservazione microscopica della crescita di cellule batteriche all'interno di GV
1. Impostare un microscopico sistema di riscaldamento con un microscopio invertito dotato di un obiettivo con apertura numerica (NA) 40x/0,6 con una lunga distanza di lavoro (Figura 1b).
2. Posizionare la camera sul microscopico sistema di riscaldamento (Figura 1b). Incubare i GV contenenti cellule batteriche nella camera in condizioni statiche per 6 ore a 37 °C.
3. Acquisisci e registra immagini al microscopio della crescita delle cellule batteriche all'interno dei GV ogni 30 minuti utilizzando una fotocamera scientifica a semiconduttore di ossido di metallo complementare (sCMOS).

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Risultati

Figura 1: Il sistema di osservazione della coltura cellulare batterica all'interno dei GV. (a) I GV sono immobilizzati su una membrana supportata attraverso il legame biotina-neutravidina sul vetro di copertura. I GV sono in...