Studio della risposta batterica all'etilene utilizzando un composto che rilascia etilene

In questo articolo

Abstract

Fonte: Augimeri, R. V. et. al., Utilizzo del composto di rilascio dell'etilene, acido 2-cloroetilfosfonico, come strumento per studiare la risposta dell'etilene nei batteri. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra l'effetto dell'etilene generato dall'acido 2-cloroetilfosfonico (CEPA) sulla crescita batterica e sulla produzione di cellulosa. L'etilene attiva le vie di segnalazione che stimolano la sintesi della cellulosa, con conseguente aumento della formazione di pellicole. Questi risultati evidenziano la risposta batterica all'etilene.

Protocollo

Saggi Pellicle
1. Coltiva e quantifica le colture starter di Komagataeibacter xylinus in triplice copia:
  1. In triplicato, inoculare una singola colonia di Komagataeibacter xylinus in 5 ml di terreno di Schramm e Hestrin (SH) (pH 5) integrato con cellulasi sterilizzata con filtro allo 0,2% (v/v). Incubare le colture a 30 °C con agitazione a 150 giri/min fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) da 0,3 a 0,4 (circa 72 ore).
  2. Raccogliere le colture starter mediante centrifugazione (2.000 x g; 4 °C; 10 min). Lavare le cellule due volte con 5 ml di soluzione fisiologica sterile e risospendere il pellet cellulare. Mantieni le celle sul ghiaccio.
  3. Quantificare le cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser.
2. Preparare le miscele master per inoculare le piastre a 24 pozzetti:
  1. Integrare 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 μl delle scorte di acido 2-cloroetilfosfonico (CEPA) 5, 50 e 500 mM per ottenere concentrazioni finali di CEPA rispettivamente di 0,01, 0,1 e 1,0 mM. Integrare altri 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 μl del solvente utilizzato per sciogliere il CEPA. Vortice per mescolare.
  2. Dividere ogni 60 ml di terreno contenente CEPA in quattro aliquote da 14 ml. Inoculare tre delle aliquote da 14 ml con repliche biologiche della coltura starter ad una concentrazione di 10-5 cellule/ml. Mantenere le provette con le cellule sul ghiaccio per prevenire la produzione di cellulosa.
    NOTA: I restanti 14 ml di aliquota saranno utilizzati per i pozzetti di controllo sterili.
3. Inoculare piastre a 24 pozzetti:
  1. Testare ogni trattamento nella propria piastra con tre file di repliche biologiche e una fila di controlli sterili (Figura 1).
  2. Utilizzando la miscela master da 14 ml, aggiungere 2 ml in ciascuno dei sei pozzetti di una piastra sterile a 24 pozzetti. Completo per le tre repliche biologiche e controllo sterile (Figura 1). Ripetere per ogni trattamento.
  3. Sigillare le piastre con pellicola di paraffina e incubare staticamente per 7 giorni a 30 °C.
  4. Raccogliere e misurare il peso secco della pellicola (resa in cellulosa) (Figura 1):
    1. Trasferire singolarmente le pellicole nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Per lisi cellulare, trattare le pellicole con 12 ml di idrossido di sodio (NaOH) 0,1 N a 80 °C per 20 minuti.
    2. Rimuovere il NaOH e neutralizzare le pellicole lavando con acqua ultrapura per 24 ore con agitazione. Cambiare l'acqua ogni 6 ore.
      NOTA: Le pellicole devono essere bianche al termine della fase di lavaggio.
    3. Posizionare le pellicole su tappetini in silicone e asciugare a 50 °C per 48 ore a peso costante. Una volta asciutti, rimuoverli dai tappetini e misurarne il peso su una bilancia analitica per determinare la resa batterica in cellulosa.

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Risultati

Figura 1: Diagramma di flusso che illustra il protocollo utilizzato per il saggio e l'analisi della pellicola. Il terreno stock integrato con CEPA a pH 7 SH (60 ml) viene aliquotato per tre inoculazioni di repliche biologiche separate e un controllo sterile (14 ml ciascun...