Amplificazione di un plasmide suicida in un ospite batterico

Abstract

Fonte: Tomás, J. M., et al. Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video dimostra l'amplificazione iniziatore-dipendente di un plasmide suicida in E. coli. Il plasmide, che trasporta un gene di resistenza agli antibiotici, si replica solo in presenza di una proteina iniziatrice codificata dall'ospite. Dopo l'elettroporazione e l'incubazione in terreno di recupero, la miscela viene impiattata su agar contenente antibiotici. I batteri con un plasmide sopravvivono, poiché la sua proteina iniziatrice consente l'espressione del gene resistente agli antibiotici del plasmide.

Protocollo

1. Generazione di mutanti nulli nei geni dell'isola di glicosilazione dei flagelli

NOTA: Questo metodo di mutagenesi si basa sullo scambio allelico di prodotti di delezione in-frame della reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando il vettore suicida pDM428 (GenBank: KC795686.1). La replicazione del vettore pDM4 è lambda pir dipendente e lo scambio allelico completo è forzato utilizzando il gene sacB situato sul vettore.

1. Costruzione di prodotti per la delezione in-frame PCR.
   1. Progettare due coppie di primer che amplificano le regioni del DNA a monte (primer A e B) e a valle (pr....

Risultati

Figura 1: Rilevamento bioinformatico di regioni cromosomiche e progettazione di primer. (A) Schema delle regioni cromosomiche identificate in A. hydrophila AH-1 e A. piscicola AH-3. L'isola di glicosilazione dei flagelli A. hydrophila AH-1 è.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ABI PRISM Big Dye Terminator v. Kit di reazione pronto per il sequenziamento del ciclo 3.1	Biosistemi Applicati	4337455	Utilizzato per il sequenziamento
AccuPrime Taq DNA polimerasi, alta fedeltà	Invitrogen	12346-086	Utilizzato per l'amplificazione di frammenti AB, CD e AD
Agarosio	Conda-Pronadise	8008	Utilizzato per l'elettroforesi del DNA
Fosfatasi alcalina intestinale del vitello (CIAP)	Promega	Motore M1821	Utilizzato per rimuovere il fosfato all'estremità 5'
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Utilizzo per l'analisi della motilità
BamHI	Promega	R6021	Utilizzato per la restrizione dell'endonucleasi
BglII	Promega	R6081	Utilizzato per la restrizione dell'endonucleasi
Sistema BioDoc-It Imagin	UVP		Stazione di bio-imaging utilizzata per la visualizzazione del DNA
Biotaq polimerasi	Bioline	BIO-21040	Utilizzato per lo screening delle colonie
Cytiva illustra GFX PCR DNA e kit di purificazione con banda in gel	Citivia	28-9034-71	Utilizzato per la purificazione di ampliconi PCR e frammenti di DNA.
EDTA	Applichem	131026.1211	Utilizzato per l'elettroforesi del DNA
Cuvette per elettroporazione 2 mm di distanza	VWR	732-1133	Utilizzato per la trasformazione
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Utilizzato per la coltura di Escherichia coli
Luria-Bertani (LB) Brodo mugnaio	Condalab	1551	Utilizzato per la coltura di Escherichia coli
Nanodrop ND-1000	Tecnologie NanoDrop Inc		Spettrofotometro utilizzato per la quantificazione del DNA
Rifampicina	Applichem	A2220,0005	Utilizzato per l'accoppiamento triparentale
SOC Medio	Invitrogen	15544034	Utilizzato per il recupero dell'elettroporazione
T4 DNA ligasi	Invitrogen	15224017	Utilizzato per la reazione di legatura
Veriti Termociclatore a 96 pozzetti	Biosistemi Applicati		Utilizzato per le reazioni di PCR