Isolamento di batteri Gram-negativi con inserzioni genomiche di trasposoni

In questo articolo

Abstract

Fonte: Kazi, M. I., et. al., Generazione di librerie di inserzione di trasposoni in batteri Gram-negativi per il sequenziamento ad alto rendimento. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la selezione, la quantificazione e la conservazione dei batteri riceventi Gram-negativi portatori di inserzioni di trasposoni basate sulla resistenza alla kanamicina.

Protocollo

Generazione della libreria finale di mutanti batterici

Scongelare un'aliquota dell'accoppiamento congelato sul ghiaccio.
Accoppiamento su piastre di agar Luria-Bertani (LB) da 150 mm integrate con kanamicina sulla base delle unità formanti colonie (CFU) calcolate al punto 3.1. Regolare il volume con LB per ottenere 13.333 colonie per 150 μl prima della piastra.
NOTA: La conta delle CFU qui è stata determinata in circa^10,5 CFU/mL, quindi il volume di accoppiamento è stato aggiustato per ottenere 13.333 colonie per piastra. Ciò fornirebbe un numero ottimale di colonie su 30 piastre per una libreria di mutanti ad alta risoluzione senza sovraffollare le piastre.
Utilizzare perle di vetro sterili per distribuire 150 μl di diluizione per piastra su piastre di agar Luria-Bertani da 30 x 150 mm integrate con kanamicina per ottenere 400.000 colonie (Figura 1C).
NOTA: Barre sterili o qualsiasi tipo di strumento di diffusione sterile (ad esempio, perle di vetro) possono essere utilizzate per diffondere i batteri sulle piastre.
Smaltire il tubo usato contenente l'accoppiamento in eccesso.
NOTA: I cicli di congelamento/scongelamento aggiungono pressioni selettive sulla coltura batterica, che possono distorcere i risultati dell'esperimento Tn-seq. Utilizzare un'aliquota nuova ogni volta.
Incubare le piastre a 37 °C per 14 ore.
NOTA: Il tempo di incubazione è ottimizzato per prevenire la crescita eccessiva (le colonie si toccano). Si consiglia di ridurre al minimo la crescita riducendo il tempo di incubazione.

Stima della densità della libreria e del pooling per l'archiviazione

Contare i CFU su ogni piastra per stimare il totale dei mutanti nella libreria dei trasposoni. Contare il 20% di almeno 3 piastre per determinare la stima del conteggio delle colonie per l'intero gruppo di piastre (Figura 2A). Assicurati che le colonie non tocchino un'altra colonia.
Dopo aver calcolato la resa stimata della colonia, aggiungere 3-5 ml di LB (o più se necessario) a ciascuna piastra e raschiare via i batteri utilizzando uno strumento raschiante sterile. NOTA: Sono stati utilizzati anelli di inoculazione sterili per raschiare in modo efficiente le piastre.
Raggruppare le sospensioni batteriche da tutte le piastre in provette coniche da 50 mL (Figura 1D). Ciò richiederà più provette coniche da 50 mL, almeno 3.
Sospensione batterica pooled in pellet mediante centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 5 mL di LB integrati con glicerolo al 30%.
Aliquotare 1 mL della libreria dei trasposoni in crioviali e conservare a -80 °C.

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Risultati

Figura 1: Schema della costruzione della libreria di mutanti dei trasposoni. (A) Coniugazione batterica. Il ceppo "donatore", che codifica il meccanismo di trasposizione, è stato mescolato con il ceppo "ricevente". La miscela è stata individuat...