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1. Trasformazione naturale
NOTA: Il derivato N315, N2-2.1 è stato utilizzato come destinatario. In questo ceppo, il locus sigH è stato duplicato in modo da esprimere costitutivamente SigH. Se il marcatore di resistenza da trasferire non è il cloramfenicolo, è possibile utilizzare pRIT-sigH (CmR) per esprimere SigH. Il plasmide purificato o l'estratto di DNA intero da S. aureus COL-45 acquisito con cfr viene utilizzato come DNA del donatore per la trasformazione.
- Preparazione del DNA del donatore
- Coltivare COL-45 per una notte agitando a 37 °C in un pallone da 300 ml contenente 50 ml di brodo di soia triptico (TSB) integrato con 32 mg/L di cloramfenicolo. Coltura di E. coli HST04 che trasporta il plasmide pHY300 (TetR) per estrarre il plasmide per l'esperimento di controllo.
NOTA: HST04 (dam-/dcm-) manca dei geni della DNA metilasi. Altri ceppi convenzionali con DNA metilasi possono essere utilizzati anche per preparare il donatore di DNA, perché lo stato di metilazione del DNA non influisce sull'efficienza della trasformazione. In alternativa, il plasmide pT181 purificato dal ceppo COL di S. aureus può essere utilizzato anche come controllo positivo per il saggio di trasformazione. - Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (8.000 x g per 10 minuti a 4 °C).
- Estrarre i plasmidi utilizzando un kit di estrazione del DNA plasmidico o un metodo di purificazione del DNA convenzionale per purificare l'intero DNA.
- Quantificare il DNA purificato con lo spettrometro e mantenerlo a 4 °C fino al momento dell'uso.
NOTA: Utilizzare una preparazione di DNA fresca per il saggio di trasformazione, di solito meno di una settimana. Le vecchie preparazioni di DNA riducono l'efficienza della trasformazione.
- Saggio di trasformazione
- Coltura della cellula ricevente (N2-2.1) per una notte in 5 ml di TSB a 37 °C con agitazione.
- Trasferire 0,5 ml di coltura notturna in una provetta da 1,5 ml. Far precipitare le cellule per centrifugazione (10.000 x g per 1 min a 4 °C).
- Sospendi le cellule con 10 mL di terreno CS2 in una provetta da 50 ml.
NOTA: Il terreno CS2 è un mezzo sintetico completo che induce competenza per la trasformazione naturale in S. aureus. Altri terreni di laboratorio standard, come il TSB o l'infusione cardiaca cerebrale (BHI), non sono adatti per la trasformazione. - Far crescere i batteri a 37 °C con agitazione (180 giri/min) fino alla fase esponenziale tardiva (circa 8 ore).
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (5.000 x g per 5 minuti a 4 °C).
- Risospendere le cellule in 10 ml di terreno CS2 fresco.
- Aggiungere 10 μg di DNA plasmidico o genomico purificato (passaggio 1.1.4) alla sospensione cellulare. Agitare a 37 °C e 180 giri/min per 2,5 ore.
NOTA: Tempi di incubazione più brevi con il DNA (<2,5 ore) si traducono in frequenze di trasformazione più basse. - Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (5.000 x g per 5 minuti a 4 °C).
- Risospendere le cellule in 10 mL di terreno BHI. Miscelare la sospensione cellulare con 90 ml di integratore di agar BHI fuso (55 °C) con 32 mg/L di cloramfenicolo (o 5 mg/L di tetraciclina nell'esperimento di controllo). Versare il composto nelle piastre Petri da 90 mm. Raffreddare rapidamente e lasciare solidificare l'agar.
- Incubare le piastre a 37 °C per 2 giorni.
- Replicare le colonie generate (trasformanti) trasferendo le colonie (utilizzando stuzzicadenti) su nuove piastre di agar BHI contenenti gli antibiotici appropriati per confermare le loro caratteristiche di resistenza. Confermare il gene di resistenza acquisito (cfr o tetM) mediante PCR di colonia.