Valutazione della mortalità indotta da batteri patogeni nelle larve di C. elegans

Abstract

Fonte: Anderson, Q. L., et al. Un patosistema C . elegans ad alto rendimento, ad alto contenuto e a base liquida. J. Vis. Exp. (2018)

Il video mostra un test a base liquida in cui larve di C. elegans geneticamente modificate sono esposte a batteri patogeni in una micropiastra. Le tossine batteriche secrete nel mezzo inducono stress e morte dell'ospite. Un colorante fluorescente colora i vermi morti, consentendo la quantificazione della mortalità basata sull'imaging per valutare la suscettibilità o la resistenza genetica.

Protocollo

1. Configurazione del saggio di uccisione dei liquidi (protocollo di base)

Nota: Questo è un protocollo per un ceppo batterico e una fonte di vermi.

1. Utilizzando un raschietto cellulare, rimuovere lo Pseudomonas aeruginosa da una piastra Slow Killing o SK e risospendere in ~ 5 mL di S Basal. Aumentare le prestazioni se necessario. Misurare la densità ottica della sospensione batterica utilizzando uno spettrofotometro (OD₆₀₀)
2. Preparare 24 mL di stock diluito di P. aeruginosa in S Basal a OD₆₀₀ ≈ 0,09 (concentrazione finale 3X). Vedere 4.6.2 per il contenuto finale per pozzetto e scalare di conseguenza il volume di diluizione batterica.
3. Aggiungere 21 mL di terreno liquido Slow Kill (3 g di NaCl, 3,5 g di peptone/L integrati con CaCl₂ e MgSO₄ fino a una concentrazione finale di 1 mM). Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 45 μL di batteri e terreni in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.
4. Lavare i vermi dalla loro fonte in una provetta conica da 50 ml e lasciare che si depositino sotto la forza gravitazionale. Aspirare il surnatante a 5 mL. Risospendere in un totale di 50 mL S basale.
5. Ripetere il passaggio 1.4 due volte.
6. Utilizzando una selezionatrice per viti a vite senza fine, selezionare circa 22 vermi in ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti.
   Nota: La configurazione rilascia ogni verme in ~1,1 μL di liquido. 22 vermi equivarranno a 25 μL, portando il volume totale del saggio a 70 μL/pozzetto.
   1. La composizione finale di ciascun pozzetto è costituita da 70 μL. 45 μL di questo volume vengono aggiunti come mezzo batterico (0,03 OD₆₀₀ batteri in 24 μL S Basal e 21 μL SK integrati con CaCl₂ e MgSO₄). Gli altri 25 μl vengono aggiunti con i 22 vermi.
   2. Se il selezionatore utilizzato qui (vedere la Tabella dei materiali) non è disponibile, i vermi possono essere diluiti a una concentrazione finale di 1 verme/μL in S basale e pipettati a 25 μL/pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Tuttavia, i risultati possono mostrare una maggiore variabilità. In alternativa, è possibile utilizzare un dosatore peristaltico di liquidi, come descritto da Leung e colleghi.
7. Dopo che i vermi sono stati smistati nella piastra a 384 pozzetti, sigillare la piastra con una pellicola permeabile ai gas e incubare le piastre a 25 °C per 24 - 48 ore.
8. All'ora desiderata, utilizzare una lavatrice per micropiastre per lavare la piastra a 384 pozzetti con S Basal per un totale di 5 volte.
   1. Dopo il secondo lavaggio, aspirare la maggior parte del terreno, lasciando ~20 μL. Agitare energicamente le piastre utilizzando un vortice per micropiastre per almeno 30 secondi per allentare eventuali detriti dal fondo dei pozzetti).
9. Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino a 20 μL. Aggiungere 50 μL di colorante di acido nucleico 0,98 μM (vedere la Tabella dei materiali)/pozzetto della piastra a 384 pozzetti, per una concentrazione finale di 0,7 μM.
10. Incubare a temperatura ambiente per 12 - 16 ore. Questo colorante macchia solo i vermi morti. Dopo il periodo di incubazione desiderato, lavare le piastre utilizzando la lavatrice per micropiastre per rimuovere eventuali macchie in eccesso (minimo 3 lavaggi).
11. Per l'acquisizione dei dati, utilizzare uno spettrofotometro o un microscopio automatizzato per visualizzare sia la luce trasmessa che la fluorescenza (531 nm di eccitazione e 593 nm di emissione).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
COPAS FP BioSorter	Unione Biometrica		Citometro a flusso per oggetti di grandi dimensioni/selezionatore di viti
Citazione 5	BioTek
EL406 Dispenser lavatrice	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Blocco RB a pozzetti profondi	Thermo Fisher Scientifico	CS15124
Piastra a 384 pozzetti	Greiner Bio-One	Codice prodotto: 781091
Terreni di crescita dei nematodi (NGM)			Quantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di NaCl, 2,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl₂ (1 M), 1 ml di MgSO₄ (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di milli-Q di acqua
Piastre Slow Killing (SK)			Quantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di NaCl, 3,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl₂ (1 M), 1 ml di MgSO₄ (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di acqua milli-Q
Media di Slow Killing (SK)			Quantità per litro: 3 grammi di NaCl, 3,5 grammi di peptone, 1 ml di CaCl₂ (1 M), 1 ml di MgSO₄ (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di milli-Q di acqua
Brodo di lisogenia (LB)	Scienze della Vita Iologiche USB	L1520
Brian Heart Brodo per infusione (BHI)	Prodotti di ricerca International Corp	50-488-526
Soluzione di candeggina per vermi			Quantità per 100 mL: 10 mL di soluzione 5 M NaOH, 20 mL di soluzione di ipoclorito di sodio al 5% e 70 mL di acqua sterile
S Basale			Quantità per litro: 5,85 grammi di NaCl, 6 grammi di KH₂PO₄, 1 grammo di K₂HPO₄ e 1 litro di acqua milli-Q
Agar	Scienze della Vita Iologiche USB	Codice A0930
NaCl	Scienze della Vita Iologiche USB	S5000
Peptone	Scienze della Vita Iologiche USB	P3300
CaCl₂	Scienze della Vita Iologiche USB
MgSO₄	Fisher Scientifico	Visualizzazione del materiale M63-500
Tampone fosfato			quantità per litro: 132 mL di K₂HPO₄ (1M) e 868 mL di KH₂PO₄ (1M)
KH₂PO₄	Acros Organics	7778-77-0
K₂HPO₄	Scienze della Vita Iologiche USB	P5100
Soluzione di ipoclorito di sodio al 5%	BICCA	7495.5-32
Soluzione NaOH	Fisher Scientifico	SS255-1
Respira facilmente	Biotecnologie diversificate	BEM-1
SYTOX Colorazione arancione dell'acido nucleico	Fisher Scientifico	Episodio 11368
Ceppi batterici
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
Superfood E. coli (OP50)
Coli Batteri che esprimono RNAi (HT115)
Ceppi di vermi
glp-4(bn2) (Beanan e Strome, 1992, PMID: 1289064)
Reporter PINK-1::GFP (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)