Valutazione della mortalità indotta da batteri patogeni nelle larve di C. elegans

Abstract

Fonte: Anderson, Q. L., et al. Un patosistema C . elegans ad alto rendimento, ad alto contenuto e a base liquida. J. Vis. Exp. (2018)

Il video mostra un test a base liquida in cui larve di C. elegans geneticamente modificate sono esposte a batteri patogeni in una micropiastra. Le tossine batteriche secrete nel mezzo inducono stress e morte dell'ospite. Un colorante fluorescente colora i vermi morti, consentendo la quantificazione della mortalità basata sull'imaging per valutare la suscettibilità o la resistenza genetica.

Protocollo

1. Configurazione del saggio di uccisione dei liquidi (protocollo di base)

Nota: Questo è un protocollo per un ceppo batterico e una fonte di vermi.

1. Utilizzando un raschietto cellulare, rimuovere lo Pseudomonas aeruginosa da una piastra Slow Killing o SK e risospendere in ~ 5 mL di S Basal. Aumentare le prestazioni se necessario. Misurare la densità ottica della sospensione batterica utilizzando uno spettrofotometro (OD₆₀₀)
2. Preparare 24 mL di stock diluito di P. aeruginosa in S Basal a OD₆₀₀ ≈ 0,09 (concentrazione finale 3X). Vedere 4.6.2 per il contenuto finale per pozzetto e scalare di conseguenza il volume di diluizione batterica.
3. Aggiungere 21 mL di terreno liquido Slow Kill (3 g di NaCl, 3,5 g di peptone/L integrati con CaCl₂ e MgSO₄ fino a una concentrazione finale di 1 mM). Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 45 μL di batteri e terreni in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.
4. Lavare i vermi dalla loro fonte in una provetta conica da 50 ml e lasciare che si depositino sotto la forza gravitazionale. Aspirare il surnatante a 5 mL. Risospendere in un totale di 50 mL S basale.
5. Ripetere il passaggio 1.4 due volte.
6. Utilizzando una selezionatrice per viti a vite senza fine, selezionare circa 22 vermi in ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti.
   Nota: La configurazione rilascia ogni verme in ~1,1 μL di liquido. 22 vermi equivarranno a 25 μL, portando il volume totale del saggio a 70 μL/pozzetto.
   1. La composizione finale di ciascun pozzetto è costituita da 70 μL. 45 μL di questo volume vengono aggiunti come mezzo batterico (0,03 OD₆₀₀ batteri in 24 μL S Basal e 21 μL SK integrati con CaCl₂ e MgSO₄). Gli altri 25 μl vengono aggiunti con i 22 vermi.
   2. Se il selezionatore utilizzato qui (vedere la Tabella dei materiali) non è disponibile, i vermi possono essere diluiti a una concentrazione finale di 1 verme/μL in S basale e pipettati a 25 μL/pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Tuttavia, i risultati possono mostrare una maggiore variabilità. In alternativa, è possibile utilizzare un dosatore peristaltico di liquidi, come descritto da Leung e colleghi.
7. Dopo che i vermi sono stati smistati nella piastra a 384 pozzetti, sigillare la piastra con una pellicola permeabile ai gas e incubare le piastre a 25 °C per 24 - 48 ore.
8. All'ora desiderata, utilizzare una lavatrice per micropiastre per lavare la piastra a 384 pozzetti con S Basal per un totale di 5 volte.
   1. Dopo il secondo lavaggio, aspirare la maggior parte del terreno, lasciando ~20 μL. Agitare energicamente le piastre utilizzando un vortice per micropiastre per almeno 30 secondi per allentare eventuali detriti dal fondo dei pozzetti).
9. Dopo il lavaggio finale, aspirare il surnatante fino a 20 μL. Aggiungere 50 μL di colorante di acido nucleico 0,98 μM (vedere la Tabella dei materiali)/pozzetto della piastra a 384 pozzetti, per una concentrazione finale di 0,7 μM.
10. Incubare a temperatura ambiente per 12 - 16 ore. Questo colorante macchia solo i vermi morti. Dopo il periodo di incubazione desiderato, lavare le piastre utilizzando la lavatrice per micropiastre per rimuovere eventuali macchie in eccesso (minimo 3 lavaggi).
11. Per l'acquisizione dei dati, utilizzare uno spettrofotometro o un microscopio automatizzato per visualizzare sia la luce trasmessa che la fluorescenza (531 nm di eccitazione e 593 nm di emissione).

Materiali