Coltura e mantenimento di batteri che esprimono RNAi

Abstract

Fonte: Anderson, Q. L., et al., Un patosistema di C. elegans ad alto rendimento, ad alto contenuto e a base liquida. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra la preparazione di batteri di interferenza dell'RNA (RNAi) che trasportano plasmidi per inibire l'espressione genica bersaglio. Delinea le fasi di selezione, crescita e induzione dei batteri RNAi per produrre piastre che esprimono dsRNA per saggi a valle.

Protocollo

1. Preparazione dei batteri di interferenza dell'RNA (RNAi)

1. Estrarre o trasferire i ceppi desiderati di batteri contenenti RNAi su piastre di agar con brodo di lisogenia (LB) contenenti antibiotici appropriati (carbenicillina a 100 μg/mL e tetraciclina a 15 μg/mL per le librerie Ahringer e Vidal) da un materiale congelato.
   Nota: Quando si lavora con batteri non patogeni, utilizzare una cappa di sicurezza biologica con livello di biosicurezza (BSL)-2 A/B o una cappa a flusso laminare BSL-1 per garantire la sterilità delle colture e ridurre al minimo la possibilità di contaminazione incrociata della libreria.
2. Incubare le piastre per 24 ore a 37 °C.
3. Conservare le piastre a 4 °C per un massimo di due settimane.
   1. Dopo due settimane, scartare le piastre e sostituirle con piastre appena fatte.
4. Testare più ceppi di RNAi in parallelo inoculando individualmente una singola colonia di ciascun clone in 4 mL di LB integrato con carbenicillina in un singolo pozzetto di una piastra a pozzetti profondi a 24 pozzetti o in una provetta sterile.  
   Nota: È stato riportato che la tetraciclina riduce l'efficienza dell'RNAi. Non utilizzarlo in questo mezzo.
5. Posizionare le piastre a pozzetti profondi a 24 pozzetti in un incubatore di agitazione ottimizzato per piastre a pozzetti multipli e incubare a 37 °C per 16 ore agitando a 950 giri/min. Nota: È difficile ottenere una crescita batterica uniforme in piastre multipozzetto utilizzando un incubatore a scuotimento convenzionale. L'incubatrice vibrante deve essere in grado di agitare a una velocità minima di 750 giri/min affinché le colture crescano correttamente. In assenza di un agitatore specializzato, è possibile coltivare ogni coltura in un singolo tubo. Le colture possono essere trasferite nella piastra a 24 pozzetti per la successiva centrifugazione.
6. Raccogliere i batteri centrifugando per 5 minuti a 2.000 x g.
7. Decantare il surnatante capovolgendo la piastra e agitando energicamente. Risospendere i batteri RNAi in 100 μL di S Basal (5,85 g di cloruro di sodio, NaCl; 1 g di fosfato dipotassico, K₂HPO₄; 6 g di fosfato monopotassico, KH₂PO₄ disciolto in 1 L di acqua ultrapura e sterilizzato in autoclave).
8. Pipettare i batteri risospesi in un numero appropriato di pozzetti di una piastra NGM multipozzetto (terreno di coltura per nematodi, 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone, 1 mM di cloruro di calcio, CaCl₂; 1 mM di solfato di magnesio, MgSO₄; 25 mL di tampone fosfato (quantità per litro: 132 mL di K₂HPO₄ (1 M) e 868 mL di KH₂PO₄ (1M)), e 18 g di agar per litro d'acqua) integrati con IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; 1 mM di concentrazione finale) e carbenicillina (100 μg/mL di concentrazione finale).
   1. Utilizzare 3,5 mL di terreno NGM per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, 1 mL per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti o 150 μL per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
   2. Utilizzare 100 μL/pozzetto di batteri per una piastra a 6 pozzetti, 50 μL/pozzetto per una piastra a 24 pozzetti o 20 μL/pozzetto per una piastra a 96 pozzetti. Lasciare asciugare.
      Nota: L'essiccazione viene normalmente eseguita in una cappa a flusso sterile per favorire un'essiccazione rapida e uniforme. L'essiccazione uniforme è molto importante. Evitare l'essiccazione eccessiva, poiché le crepe nell'agar favoriscono lo scavo dei vermi. Ciò porta a perdite di viti senza fine e al potenziale intasamento dei sistemi di movimentazione dei liquidi.
9. Utilizzare immediatamente le piastre preparate o conservarle a 4 °C per un massimo di due settimane per un uso successivo.
   Nota: Per evitare che i piatti si secchino, possono essere sigillati con un film di paraffina di plastica o posti in un contenitore ermeticamente chiuso con tovaglioli di carta umidi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
24 blocchi RB a pozzetti profondi	Thermo Fisher Scientifico	CS15124
Terreni di crescita dei nematodi (NGM)			Quantità per litro: 18 grammi di agar, 3 grammi di cloruro di sodio, 2,5 grammi di peptone, 1 ml di cloruro di calcio (1 M), 1 ml di solfato di magnesio (1 M), 25 ml di tampone fosfato e 973 ml di acqua milli-Q
Brodo di lisogenia (LB)	Scienze della Vita Iologiche USB	L1520
S Basale			Quantità per litro: 5,85 grammi di cloruro di sodio, 6 grammi di fosfato monopotassico, 1 grammo di fosfato dipotassico e 1 litro di acqua milli-Q
Agar	Scienze della Vita Iologiche USB	Codice A0930
Cloruro di sodio	Scienze della Vita Iologiche USB	S5000
Peptone	Scienze della Vita Iologiche USB	P3300
Cloruro di calcio	Scienze della Vita Iologiche USB
Solfato di magnesio	Fisher Scientifico	Visualizzazione del materiale M63-500
Tampone fosfato			Quantità per litro: 132 mL di fosfato dipotassico (1 M) e 868 mL di fosfato monopotassico (1 M)
Fosfato monopotassico	Acros Organics	7778-77-0
Fosfato dipotassico	Scienze della Vita Iologiche USB	P5100