Espressione dell'operone di luminescenza nei batteri marini bioluminescenti

Abstract

Fonte: Brodl, E., et al. Sul posto Misura e correlazione della densità cellulare e dell'emissione luminosa di batteri bioluminescenti. J. Vis. Exp. 1 (2018)

Questo video mostra la coltivazione di batteri bioluminescenti marini per osservare l'attivazione mediata dal quorum sensing dell'operone di luminescenza, consentendo il monitoraggio in tempo reale dell'espressione genica e dell'emissione di luce per studi sulla comunicazione microbica e la regolazione genica.

Protocollo

1. Espressione di ceppi batterici bioluminescenti

NOTA: I ceppi batterici bioluminescenti richiedono un terreno di crescita specifico/terreno di acqua di mare artificiale per la crescita e la produzione di luce.

1. Preparare un substrato di acqua di mare artificiale, composto da due componenti del substrato preparati separatamente.
   NOTA: Le seguenti quantità si riferiscono a 1 L di terreno liquido o 1 L di terreno agar.
   1. Per il mezzo di acqua di mare artificiale, pesare i seguenti sali: 28,13 g di NaCl (cloruro di sodio), 0,77 g di KCl (cloruro di potassio), 1,60 g di CaCl₂ · 2H₂O (cloruro di calcio diidrato), 4,80 g di MgCl₂ · 6H₂O (cloruro di magnesio esaidrato), 0,11 g di NaHCO₃ (bicarbonato di sodio) e 3,50 g di MgSO₄ · 7H₂O (solfato di magnesio eptaidrato).
   2. Aggiungere 1 L di acqua distillata e sciogliere tutti i componenti.
   3. Per LB (Luria-Bertani) medio, pesare i seguenti ingredienti: 10 g di estratto di lievito, 10 g di peptone e, per le piastre di agar, altri 20 g di agar.
   4. Aggiungere 250 ml di acqua di rubinetto e sciogliere i componenti.
   5. Autoclavare separatamente entrambi i terreni preparati a 121 °C per 20 minuti.
   6. Per le piastre di agar, combinare 250 mL di terreno LB con 750 mL di terreno di acqua di mare artificiale subito dopo la sterilizzazione in autoclave e preparare le piastre.
   7. Per il terreno liquido, combinare 250 mL di terreno LB con 750 mL di terreno di acqua di mare artificiale subito dopo la sterilizzazione in autoclave o quando si è raffreddato.
      NOTA: Il mezzo artificiale dell'acqua di mare può diventare torbido a causa della precipitazione salina.
2. Striare i ceppi batterici bioluminescenti su piastre artificiali di agar con acqua di mare e incubare per una notte a 24 - 30 °C.
   NOTA: La conservazione a lungo termine dei ceppi batterici si ottiene normalmente attraverso il congelamento delle scorte di glicerolo della coltura batterica. I ceppi devono essere sempre strisciati su piastre di agar per garantire condizioni di partenza uniformi per tutti i ceppi, prima dell'uso per colture liquide, a causa di una fase di ritardo nella crescita dopo lo scongelamento.
3. Preparare un ONC (coltura notturna) inoculando 100 ml di terreno di acqua di mare artificiale con una singola colonia dalla piastra. Incubare l'ONC a 24 - 30 °C e 120 giri/min in un agitatore incubatore per una notte.
4. Inoculare 800 ml di terreno di acqua di mare artificiale con 8 ml di ONC.
5. Incubare le cellule batteriche a 24 - 30 °C e 120 giri/min in un agitatore per incubatore.
   NOTA: Il profilo di intensità luminosa dei batteri bioluminescenti varia fortemente con la temperatura. A seconda dei meccanismi di regolazione della produzione di luce del rispettivo ceppo batterico, l'emissione di luce può iniziare dopo circa 1 - 6 ore.
6. Osservare la coltura cellulare batterica fino a quando non iniziano a brillare (circa 1 - 6 ore).
   NOTA: A seconda dello scopo dell'espressione, le cellule vengono coltivate fino al giorno successivo e poi raccolte, oppure le cellule possono essere mantenute in movimento finché brillano. La raccolta delle cellule e la purificazione di qualsiasi proteina possono essere eseguite secondo le procedure standard.

Materiali