Analisi microscopica della crescita batterica sotto stress mediante camere microfluidiche

Abstract

Fonte: Cayron, J., et al. Analisi multiscala della crescita batterica sotto stress. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra come preparare e utilizzare una piastra microfluidica per l'imaging di cellule batteriche in condizioni di stress. Delinea il processo di introduzione di una coltura batterica e di un mezzo antibiotico che induce stress, seguito dal caricamento cellulare e dal setup microscopico. L'imaging time-lapse in modalità contrasto di fase viene quindi utilizzato per osservare lo sviluppo di cellule allungate e filamentose con un aumento del contenuto di DNA dovuto all'inibizione della divisione cellulare.

Protocollo

1. Imaging al microscopio time-lapse Microfluidics
   1. Rimuovere la soluzione di conservazione dalla piastra microfluidica e sostituirla con un terreno fresco preriscaldato a 37 °C, come descritto nella guida per l'utente del software microfluidico.
   2. Sigillare la piastra microfluidica al sistema del collettore e fare clic sul pulsante Priming.
   3. Posizionare la piastra microfluidica con il sistema di collettori sul tavolino del microscopio e preriscaldare a 37 °C per ~2 ore prima di iniziare l'acquisizione al microscopio.
      NOTA: Questa fase di preriscaldamento è fondamentale per evitare la dilatazione della camera microfluidica, che altererebbe la messa a fuoco del microscopio durante l'esperimento time-lapse e comprometterebbe l'acquisizione dell'immagine.
   4. Sigillare la piastra microfluidica. Sostituire il terreno dal pozzetto 8 con 150 μl di campione di coltura e sostituire il terreno dal pozzetto 1 al 5 con il terreno desiderato con o senza il reagente che induce lo stress.
   5. Sigillare la piastra microfluidica e posizionarla sul tavolino del microscopio.
   6. Sul software microfluidico eseguire la procedura di caricamento della cella. Verificare che il carico delle celle sia soddisfacente guardando al microscopio in luce trasmessa. Eseguire la procedura di caricamento delle celle una seconda volta se la densità delle celle nella camera è insufficiente.
   7. Eseguire un'attenta messa a fuoco in modalità luce trasmessa e selezionare diversi campi visivi che mostrano batteri isolati. È importante selezionare campi che non siano sovraffollati per poter monitorare la crescita delle cellule isolate nel tempo (si consiglia ~10-20 cellule per 100 μm²). Ciò faciliterà anche il rilevamento delle cellule durante l'analisi delle immagini.
   8. Sul software microfluidico, fare clic sul pulsante Crea un protocollo. Programmare l'iniezione del terreno di crescita per 1-2 equivalenti al tempo di generazione per consentire alle cellule di adattarsi (opzionale). Quindi programmare l'iniezione del mezzo che induce lo stress per 10 minuti a 2 psi, seguita dall'iniezione a 1 psi per la durata desiderata del trattamento da stress. Se si intende analizzare il recupero delle cellule dopo lo stress, programmare l'iniezione di terreno di crescita fresco per la durata desiderata.
      NOTA: Nell'esperimento qui presentato, la cefalexina è stata iniettata per 10 minuti a 2 psi, seguita da 50 minuti a 1 psi. Quindi, il terreno di crescita fresco è stato iniettato a 2 psi per 10 minuti, seguito da 3 ore a 1 psi.
   9. Esegui l'imaging al microscopio in modalità time-lapse con 1 fotogramma ogni 10 minuti utilizzando il contrasto di fase in luce trasmessa e una sorgente luminosa di eccitazione a 560 nm per il segnale mCherry, se necessario.
      NOTA: È importante avviare l'acquisizione di immagini microscopiche contemporaneamente all'avvio del protocollo di iniezione microfluidica.

Materiali