L'etichettatura di F-actina Finisce spinato con Rodamina-actina in permeabilizzate coni di crescita neuronale

Sommario

Un metodo per visualizzare e quantificare F-actina finisce spinato nei coni di crescita neuronale è descritto. Dopo i neuroni colture sulla coprioggetto di vetro, le cellule sono permeabilizzate con una soluzione contenente saponina. Poi, una breve incubazione con il buffer che contiene saponina rodamina-actina actina incorpora fluorescenti sul termina actina libera spinato.

Abstract

Le punte mobili di assoni in crescita sono chiamati coni di crescita. Coni di crescita degli assoni conducono navigare attraverso i tessuti in via di sviluppo, interagendo con spunti a livello locale ha espresso la guida molecolare che si legano recettori cono di crescita e regolano le dinamiche e l'organizzazione del citoscheletro cono di crescita del ^3-6. L'obiettivo principale di questi segnali di navigazione è il reticolo di filamenti di actina che riempie la periferia cono di crescita e che la crescita unità motilità del cono attraverso la polimerizzazione di actina e continuo rimodellamento dinamico ^7. Spunti interessanti indicazioni positive o indurre il cono di crescita di svolta stimolando filamenti di actina (F-actina) polimerizzazione nella regione della periferia cono di crescita che è più vicino alla fonte della stecca attrattiva. Questa la polimerizzazione di actina unità locali cono di crescita sporgenza, l'adesione del margine di leader e di allungamento assonale verso l'attrattore.

Polimerizzazione filamento dipende dalla disponibilità di monomero di actina sufficiente e su nuclei di polimerizzazione o termina filamenti di actina spinato per l'aggiunta di monomero. Actina monomero è abbondantemente disponibile nel ganglio della radice pulcino della retina e dorsale (DRG) coni di crescita. Di conseguenza, polimerizzazione aumenta rapidamente quando libero F-actina finisce spinato diventano disponibili per oltre monomero. Ciò si verifica in pulcino DRG e coni di crescita della retina mediante l'attivazione locale della F-actina actina rottura delle proteine ​​depolimerizzazione fattore (ADF / cofilina) nella regione del cono di crescita più vicini ad un ^80-10 attrattivo. Questa accresciuta ADF / cofilina attività separa i filamenti di actina per creare nuovi F-actina finisce spinato per la polimerizzazione. Il metodo seguito viene illustrato questo meccanismo. Contenuto totale di F-actina sono visibili con la colorazione falloidina fluorescenti. F-actina finisce spinato sono visualizzati con l'incorporamento di rodamina-actina all'interno di coni di crescita che sono permeabilizzate con la procedura descritta nel seguente, che è tratto da studi precedenti di altre cellule mobili ^{11, 12.} Quando rodamina-actina è aggiunto ad una concentrazione al di sopra della concentrazione critica per oltre monomero di actina a fini spinato, rodamina-actina assembla sulla libera finisce spinato. Se lo spunto interessante è presentato in un gradiente, come essere liberati da una micropipetta posizionata su un lato di un cono di crescita, l'incorporazione di rodamina-actina su F-actina finisce spinato sarà maggiore nella parte cono di crescita verso la micropipetta ¹⁰ .

Coni di crescita sono strutture a piccole cellule e delicato. Le procedure di permeabilizzazione, rodamina-actina incorporazione, la fissazione e la visualizzazione di fluorescenza sono tutte curate e possono essere effettuate sul palcoscenico di un microscopio invertito. Questi metodi possono essere applicati allo studio di polimerizzazione locali actina nei neuroni migrazione, altre cellule del tessuto primarie o linee cellulari.

Protocollo

Per rodamina-actina l'etichettatura, i neuroni sono coltivati ​​su coprioggetto di vetro posto nella parte inferiore di 35 piatti di plastica mm, o su vetrini incollati in "video" piatti.

1. Preparazione del coprioggetto o "Video" Piatti

1. Molti tipi di neuroni sono scarsamente adesivo per substrati in vitro. Coprioggetto di vetro, che sono necessari per questa procedura, potrebbe non consentire sufficiente neurone-substrato di adesione a meno che non siano adeguatamente puliti e preparati. Una procedura dettagliata per l'acido di lavaggio e pulizia coprioggetto di vetro è descritto nel libro coltura cellule nervose, a cura di banchiere e Goslin. In alternativa, un rivestimento di nitrocellulosa per coprioggetto, che si lega avidamente molecole di substrato, è descritto nei passi 1.7 e 1.8 di seguito.
2. Vetro coprioggetti (es. 18 o 24 millimetri quadrati cerchi mm) sono risciacquati in dH ₂ O e cotto a calore secco (≥ 225 ° C) più a lungo possibile (almeno alcuni giorni fino a tre mesi o più) per rimuovere le tracce di sostanze organiche composti. Passare al punto 1.6 o per i piatti il ​​video procede a 1,3.
3. Per creare un sottile substrato di vetro trasparente per videomicroscopia ad alta risoluzione, fori circolari di diametro appropriato sono perforati nel fondo di 35 o 50 millimetri Petri in plastica o piatti di coltura di tessuti utilizzando una sonda elettrica sughero (o uno strumento analogo). Foratura avviene lentamente con una leggera pressione per evitare di rompere la plastica. Bordi del foro sono raschiati con le forbici per creare una superficie liscia su entrambi i lati.
4. Coprioggetto di vetro sono puliti per l'utilizzo di coltura, come descritto in 1.1 o 1.2. Coprioggetto sono incollati al posto sopra i fori, usando non tossico cemento acquario silicone (per coprioggetto 18x18mm, un po 'diametro 12mm è utilizzato). Il cemento è curata per 24 ore.
5. (I seguenti passaggi sono fatto utilizzando condizioni sterili) I piatti video sono risciacquati 3 volte con sterili dH ₂ O e lasciati asciugare all'aria.
6. Coprioggetto sono rivestite di molecole substrato neuronale per la cultura. In primo luogo, la superficie è rivestita con coprioggetto (250 microlitri per coprioggetto 18x18) una soluzione di 100 mg / ml poli-D-lisina in PBS per 4-8 ore (o una notte) in un umidificata 38 ° C. Coprioggetto vengono poi risciacquati 3 volte con sterili dH ₂ O per rimuovere legato poli-D-lisina e lasciato asciugare all'aria. Molti tipi di neuroni sono coltivate su vetrini rivestiti di poli-D-lisina da solo, se le proteine ​​del siero sono compresi nel mezzo di coltura. Tuttavia, i risultati più rilevanti per le condizioni in vivo sono ottenuti utilizzando molecole di substrato naturale. Le soluzioni di queste molecole, come laminina, fibronectina o L1 CAM (1-20 mg / ml in PBS), può essere direttamente applicato vetrini rivestiti di poli-D-lisina per 4-8 ore o durante la notte, ma nel nostro laboratorio di routine mano i coprioggetti preparata con un sottile strato di nitrocellulosa prima di applicare molecole di adesione cellulare per aumentare la proteina-substrato vincolanti.
7. Fare una soluzione di nitrocellulosa 1% in nitrocellulosa sciogliendo 5 g in 5 ml di 100% acetato di amile. Applicare 10 ml di questa soluzione per il coprioggetto e delicatamente tutta la superficie. Aria secca 10 minuti.
8. Applicare 250 microlitri di una soluzione di 25 mg / ml laminina o 4 mg / mL L1 CAM in PBS e in tutta la superficie nitrocellulosa. Incubare 4 ore (o durante la notte) in un umidificata 38 ° C, substrato aspirare e aggiungere immediatamente terreno di coltura, in modo che il substrato non si secchi.

2. Preparazione delle Culture neuronale

1. Embrionali giorno 7 embrioni di pollo vengono rimossi da uova, e collocati in 100 piatti millimetri Petri contenenti terreno di coltura con 10% siero per la dissezione, per rimuovere gli organi interni dal torace e l'addome, utilizzando uno stereomicroscopio.
2. Gli embrioni vengono poi risciacquati con medio e trasferito in un piatto di 60 mm con ambiente liquido e ulteriormente sezionato per rimuovere e preparare espianti di gangli delle radici dorsali (DRG) o tessuti neurali della retina. Una descrizione dettagliata dissezione può essere trovato in Metodi di Biologia Cellulare, volume 71, Neuroni: Metodi e Applicazioni per il biologo cellulare, a cura di Hollenbeck e Bamberga. Espianti DRG sono gangli 1/2-whole e neurali espianti retinici sono 1 mm o meno di diametro.
3. Dopo aver pulito la espianti di tessuti estranei, gli espianti individuali sono mosso con pinze orologiai per i coprioggetti, che sono già in capsule di Petri con il terreno di coltura. Sotto un microscopio da dissezione, l'espianto viene delicatamente premuto al centro del vetrino con una pinza per evitare movimenti durante il trasporto al incubatrice. Espianti sono coltivate in media con F12 B27 additivi, tamponata con 10 mM HEPES a pH 7.4 e messo la notte in un umidificata 38 ° C. I fattori di crescita possono essere aggiunti, se necessario, al mezzo di coltura. Neurotrofine sono spesso aggiunti ai DRG culture di anziani embrioni, anche se E7 neuroni DRG si estenderà assoni da espianti senza neurotrofine aggiunto. Espianti di retina neurale estendere assoni in questo terreno di coltura senzadding fattori di crescita.
4. Le culture sono incubate per almeno 18 ore per consentire sufficiente crescita degli assoni, prima di iniziare la procedura di seguito.

3. Preparazione di Rodamina-actina Buffer permeabilizzazione

1. Una soluzione tampone stock di permeabilizzazione contenente 138 mM KCl, 10 TUBI mm, 3 mm EGTA, 4mm MgCl ₂ e 1% BSA (pH = 6,9) può essere mantenuta fino a 2 settimane a 4 ° C11. Appena prima dell'uso, i seguenti componenti sono aggiunti per una concentrazione finale di: 0,025% saponina, 0,1 mM ATP, e 100 nM-Alexa Fluor 350 falloidina.
2. Una soluzione a parte è anche preparata al momento dell'uso con questi stessi componenti più 0.45μM rodamina non muscolo actina La soluzione è alternativamente agitazione orizzontale e tritrated per 5 minuti per sciogliere rodamina-actina grumi, ed è in agitazione per 1 minuto durante la fase iniziale di permeabilizzazione per prevenire la polimerizzazione nel tubo. Se, nonostante questo, il montaggio filamento nel tubo rimane un problema, la soluzione può essere centrifugati prima dell'uso.

4. Permeabilizzazione delle Culture e Integrazione della neuronale Rodamina-actina su F-actina Ends spinato

1. Un piatto cultura con espianti DRG o della retina viene accuratamente rimossa dal termostato e le seguenti operazioni vengono eseguite a temperatura ambiente.
2. Tutte le modifiche delle soluzioni deve essere fatto attentamente. La punta della pipetta deve essere posizionato sul bordo del vetrino e le soluzioni devono essere rimosso e aggiunto lentamente e con una forza minima.
3. Il terreno di coltura viene rimosso dalla pipetta con attenzione, ma costantemente, e con un tampone permeabilizzazione sufficiente a coprire le cellule si aggiunge per 1 min (per 18 millimetri x 18mm coprioggetto, ~ 60 mL). La cultura non è risciacquata con altre soluzioni prima di aggiungere il buffer permeabilizzazione, e il coprioggetto non si lascia asciugare prima di aggiungere il buffer di permeabilizzazione.
4. Il buffer di permeabilizzazione viene delicatamente rimosso dalla pipetta e sostituito con il buffer permeabilizzazione contenente 0,45 rodamina mM non actina muscolare per 4 min.
5. La rodamina-actina-contenente tampone viene delicatamente rimosso tramite una pipetta, ei neuroni sono fissati con l'aggiunta di una soluzione di paraformaldeide al 4% (da laboratorio, fatta con tampone fosfato, pH 7,3), 0,05% glutaraldeide e il 10% di saccarosio. Dopo 5 minuti la fissazione coprioggetto sono delicatamente sciacquati con PBS, e montato in Slowfade il 3 pollici vetrini.
6. Un approccio alternativo alle soluzioni cambiamento è quello di utilizzare una cella di flusso. Questa può essere una cella a flusso disponibile in commercio, o di una cella di flusso semplice può essere fatto mettendo piccoli pezzi di plastica (≤ 1 mm di spessore) come distanziatori agli angoli del vetrino, e poi si monta una uguale dimensione coprioggetto sulla parte superiore del coprioggetto. Le soluzioni possono essere scambiati mettendo la pipetta ad un lato della cella di flusso e della revoca soluzioni con uno stoppino (cotone o un Kimwipe) dall'altra parte.
7. L'incorporazione di rodamina-actina su F-actina finisce spinato e fluorescenti-falloidina etichettatura di F-actina in coni di crescita è visualizzato con epi-fluorescenza ottica con un obiettivo 60X immersione in olio, e le immagini sono raccolte, con una camera CCD raffreddata. Un microscopio confocale può fornire immagini migliori.
8. Per una migliore quantificazione della rodamina-actina incorporazione di tutte le immagini devono essere raccolti in una sola sessione, utilizzando lo stesso guadagno e le impostazioni di esposizione la sensibilità della fotocamera digitale per ogni immagine. Analisi di etichettatura dovrebbe essere fatto dalle regioni equivalente per ogni immagine Metamorph, Immagine J o simili strumenti informatici per l'analisi delle immagini può essere utilizzato.

VARIAZIONI DI QUESTA PROCEDURA

5. Una variante: Raccogliere Immagini Live Cell Prima Rodamina-actina Etichettatura

1. Video piatti sono posti su un palco microscopio riscaldato, e vivere le immagini cono di crescita sono stati raccolti. Coprioggetto griglia può essere utilizzato, o incisioni e / o segni penna sul vetrino può essere fatto per trovare più facilmente le cellule specifico dopo l'etichettatura, o il piatto video può essere fissato in posto sul palco microscopio per tutta la durata della procedura.
2. Permeabilizzazione, incorporazione di rodamina-actina, e la fissazione delle cellule sono condotte nel piatto video, sia su o giù dal palco microscopio. Dopo il fissaggio, PBS si aggiunge ai piatti il ​​video per l'imaging immediata. Per preservare il campione per l'imaging in seguito, media slowfade montaggio viene aggiunto al coprioggetto e un coprioggetto di uguali dimensioni si posa delicatamente sulla parte superiore (evitando bolle), e poi i bordi sono sigillati con smalto trasparente.

6. Variante due: immunochimica di Co-label proteine ​​aggiuntive

1. Rodamina-actina incorporazione e fissazione può essere condotto sui neuroni coltivati ​​su vetrini o in piatti di video, come descritto in precedenza (4,2-4,4).
2. Dopo la fissazione, e risciacquo in PBS, le cellule vengono trattate 15 minuti con 0,1 M glicina in PBS e poi estratto con 0,1% Triton X-100 (TX-100) in PBS con siero di capra al 2% e 1% di BSA per 1 h. Coprioggettovengono incubati con gli anticorpi primari diluiti in PBS contenente BSA 1% per 1 h. I coprioggetti vengono poi risciacquati e incubate a 0,1% TX-100 in PBS con siero di capra al 2% e 1% di BSA per 1 ora, prima di applicare gli anticorpi secondari fluorescenti a diluizione 1:1000 in PBS con BSA 1% per 1 h. Dopo il risciacquo, i coprioggetti sono di nuovo incubati in 0,1% TX-100 in PBS con siero di capra al 2% e 1% di BSA per 30 minuti, risciacquato, e montato in anti-sbiadimento media. La localizzazione di alcune proteine ​​viene interrotto dal passo permeabilizzazione iniziale (4,3). Per mantenere queste proteine ​​per la localizzazione con gli anticorpi, 0,05% e 0,05% paraformaldeide glutaraldeide può essere aggiunta al buffer permeabilizzazione per 1 minuto (cioè prima di aggiungere il rodamina-actina) senza alterare l'etichettatura spinato fine di rodamina-actina.
3. Immagini di coni di crescita triplo etichettati sono raccolti al microscopio a fluorescenza o confocale.

7. Variazione Tre: valutazione degli effetti di Cues Guida alla F-actina estremità libere spinato

1. Un fattore di crescita o spunto guida si aggiunge ai piatti della cultura in incubatrice a concentrazioni di alcuni ng / mL per qualche minuto (o un tempo di trattamento appropriato) prima di rimuovere l'antenna dal termostato e iniziare la procedura di permeabilizzazione. Ciò consente di valutare a breve termine gli effetti di fattori di crescita o di indicazioni di guida su F-actina estremità libere spinato.
2. Un piatto video con culture neuronali può essere posizionato su un palco microscopio riscaldato, e fattori di crescita o indicazioni di guida può essere rilasciata da una micropipetta in un gradiente in prossimità di un cono di crescita prima di iniziare la permeabilizzazione e rodamina-actina incorporazione. Per esempio, NGF può essere rilasciato per DRG neuroni o netrina per neurali cellule gangliari della retina. La pipetta può essere introdotta per la più breve 1-2 minuti prima di iniziare la procedura di permeabilizzazione. Ciò permette la valutazione degli effetti locali di un gradiente di guida spunto sulla formazione di F-actina estremità libere spinato dei margini di cono di crescita importanti (vedi citazione di riferimento 10 per le immagini).
3. Queste variazioni possono essere combinati con anticorpo-mediata etichettatura di altri componenti neuronali, come descritto al precedente punto 6.2.

8. Quattro variazione: F-actina Etichettatura gratis Fine spinato sui neuroni transfettati

1. L'uso di costrutti costitutivamente attivo o dominante negativo o knockdown proteine ​​mediante RNAi (con un marcatore fluorescente identificazione) può essere utilizzato per valutare il coinvolgimento di una proteina nella regolazione della F-actina estremità libere spinato. A seconda delle proteine, la sua localizzazione all'interno del cono di crescita, e se è fusa ad un tag fluorescente, la proteina fluorescente espressi nelle cellule transfettate possono essere persi su permeabilizzazione. Se questo è il caso, i piatti video può essere utilizzato per identificare una cellula transfettate microscopio prima di permeabilizzazione e la permeabilizzazione può essere effettuata sul palco microscopio, dopo aver segnato le posizioni di cellule transfettate. In alternativa, un costrutto GFP-actina può essere co-trasfettate con GFP-costruire di interesse. In questo caso, GFP-actina saranno inseriti in F-actina, e non sarà perso da permeabilizzazione che consenta l'identificazione delle cellule transfettate dopo permeabilizzazione.
2. Questa variazione può essere combinato con l'aggiunta di indicazioni di guida, come descritto nella 7,1-7,3 sopra.

9. Rappresentante Risultati

Figura 1. Inoltre globale di NGF aumenta totale F-actina e F-actina termina spinato al margine cono di crescita importanti. Quando un cono di crescita DRG viene stimolato con fattore di crescita nervosa (NGF) per 5 minuti, la polimerizzazione di actina è stimolato al margine leader, e una fascia luminosa della rodamina-actina etichettatura è visto intorno alla periferia cono di crescita. La figura 1 confronta rodamina-actina incorporazione in un cono DRG non stimolato la crescita e l'NGF-stimolata cono di crescita DRG. La fluorescenza verde nelle immagini fuse è etichettatura falloidina di F-actina nel cono di crescita e il rosso è rodamina-actina etichettatura. Un buon controllo per l'etichettatura fine spinato è quello di aggiungere 10-6 M o superiore citocalasina B o D nel buffer di permeabilizzazione in passi 4.2 e 4.3. Cytochalasins tappo F-actina finisce spinato e inibire rodamina-actina vincolante a fini spinato. Questo dovrebbe ridurre drasticamente o eliminare l'incorporazione di rodamina-actina nella cella. Barre di scala, 10 micron.

Figura 2. Un gradiente di NGF aumenta a livello locale di F-actina finisce spinato. Una micropipetta che rilascia NGF è portato a un lato di un cono di crescita DRG per 2 minuti, seguito da etichettatura di F-actina estremità libere spinato. Le immagini qui sotto mostrano che l'esposizione a un gradiente di NGF stimola a livello locale un aumento di F-actina estremità libere spinato nella regione del cono di crescita più vicini alla pipetta. L'immagine mostra falloidina fuse in verdee rodamina-actina in rosso. Scala grafica, 10 micron.

Figura 3. Proteine ​​ERM attivato accumulano al margine cono di crescita importanti. Etichettatura immunocitochimica di phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (Perm) con F-actina estremità libere spinato. Gluteraldehyde (0,05%) e paraformaldeide (0,05%) sono stati aggiunti al tampone permeabilizzazione iniziale per un minimo di conservare la localizzazione AEC. Rodamina-actina, rosso; PERM, verde; falloidina, blu. Scala grafica, 10 micron.

Figura 4. La stimolazione di polimerizzazione dell'actina richiede proteine ​​ERM attivo. DRG dissociata sono stati co-trasfettate con GFP-actina e un controllo GFP plasmide o un dominante negativo Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) costruire. L'uso di GFP-actina permette l'identificazione di cellule transfettate dopo permeabilizzazione. Qui, NGF è stato aggiunto 5 min prima dell'etichettatura di F-actina finisce spinato. Si noti il ​​cono di crescita transfettate con DN ERM ha ridotto i livelli di fine spinato al margine cono di crescita iniziale (pannello inferiore centrale), che contrasta con un cono di crescita vicina untransfected (pannelli inferiori), o con il controllo GFP (pannello centrale superiore). Rodamina-actina, rosso; GFP-actina, verde. Barre di scala, 10 micron.

Discussione

I metodi qui presentati permettono risoluzione temporale e spaziale dei componenti cellulari che sono coinvolti nel rimodellamento dinamica del citoscheletro di actina al margine leader di migrazione coni di crescita. L'azione di molecole attrattivo, come NGF o netrina, per stimolare rapidamente polimerizzazione filamento si rivela come un aumento locale finisce actina spinato, creato da rottura di filamenti di actina attivato ADF / cofilina ^10, come indicato nelle figure 1 e 2. Il metodo permette la loca...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coverslip 18x18 mm	Gold Seal	3305
Piastre di Petri da 35 mm	Falcon BD	351008
Colla per acquari		Sigillante per acquario in silicone al 100% DAP	Qualsiasi negozio di ferramenta
Poli-D-lisina (pm > 300.000)	Sigma-Aldrich	P1024
Laminina murina naturale	Invitrogen	23017-015
L1 CAM	R&D Systems	777-NC
Phalloidina Alexa-fluor 350	Invitrogen	A22281
Actina non muscolare rodamina	Cytoskeleton, Inc.	APHR-A
Mezzo di coltura F12	Invitrogen	21700-075
B27	Invitrogen	17504-044
Slowfade	Invitrogen	536937