Valutazione dello sciame batterico utilizzando una piastra inibitrice del gradiente

Abstract

Fonte: Guo, S., et al. Quantificazione della motilità della sciamatura batterica superficiale su piastre a gradiente induttore. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra l'uso di una piastra a sciame a gradiente a doppio strato per studiare il comportamento della sciamatura batterica al variare delle concentrazioni di inibitori. Una piastra con un inibitore che forma gradiente nello strato inferiore viene inoculata con batteri e incubata. Le immagini vengono acquisite a intervalli regolari per analizzare l'effetto della concentrazione di inibitori sullo sciame batterico.

Protocollo

1. Preparazione delle piastre a sciame gradiente

1. Preparazione del mezzo dello sciame
   NOTA: In questo protocollo è stata utilizzata una concentrazione di agar dello 0,7% (p/v) del mezzo di sciame.
   1. Preparare il brodo di Lisogenesi (LB) in polvere con agar in due matracci conici; ogni pallone contiene 2 g di triptone, 2 g di cloruro di sodio (NaCl), 1 g di estratto di lievito e 1,4 g di agar. Aggiungere acqua bidistillata (ddH₂O) e mescolare la sospensione utilizzando un'ancoretta magnetica. Regolare il volume finale a 200 ml aggiungendo ulteriori ddH₂O.
   2. Autoclavare la soluzione in autoclave a 121 °C per 20 min. Utilizzare un tappo permeabile all'aria o una pellicola sigillante per bottiglie con una presa d'aria.
      NOTA: L'agar si dissolve quando viene riscaldato in autoclave.
   3. Quando la temperatura scende a 65 °C, mescolare la soluzione per garantire l'omogeneità e trasferire il fluido in un'incubatrice a 65 °C o in un bagnomaria per un uso a breve termine.
2. Preparazione del mezzo di sciame dello strato inferiore
   NOTA: Il mezzo dello strato inferiore è la miscela di mezzo a sciame e soluzioni madre induttrici. La formulazione delle piastre a sciame a gradiente induttore è mostrata nella Tabella 1.
   1. Preparare una soluzione madre di resveratrolo da 100 mM sciogliendo 114,12 mg di polvere di resveratrolo liofilizzato in 5 mL di dimetilsolfossido (DMSO) e conservare la soluzione a -20 °C.
   2. Preparare una soluzione madre di arabinosio al 20% (p/v) sciogliendo 6 g di polvere di arabinosio in 30 mL di ddH₂O; attendere 10-15 min per permettere all'arabinosio di sciogliersi; e conservare la soluzione a temperatura ambiente.
   3. Estrarre il fluido dall'incubatrice a 65 °C e posizionarlo a temperatura ambiente; lasciare raffreddare il mezzo di coltura fino a quando il pallone di Erlenmeyer non si è sufficientemente freddo da contenere (~50 °C). Non posizionare il mezzo dello sciame a temperatura ambiente per lunghi periodi, poiché ciò causerebbe la solidificazione dell'agar.
   4. Aggiungere il volume necessario della soluzione madre dell'induttore al mezzo dello sciame a 50 °C (tabella 1). Utilizzare una pipetta per erogare la soluzione dell'induttore invece di versarla. Agitare delicatamente per mescolare l'induttore con il mezzo dello sciame.
      NOTA: Questo passaggio è per gli induttori che non possono essere sterilizzati in autoclave. Fare attenzione a non introdurre bolle nel mezzo.
3. Preparazione di piastre a sciame a gradiente a doppio strato
   NOTA: Il terreno dello strato superiore è un terreno LB contenente lo 0,7% (p/v) di agar.
   1. Etichettare le piastre di Petri quadrate da 13 x 13 cm con il nome dell'induttore e i ceppi e appoggiare le piastre oltre il bordo dei coperchi (Figura 1B).
   2. Aggiungere 40 mL di terreno caldo per lo strato inferiore (50 °C) utilizzando una pipetta da 50 mL o una provetta da centrifuga da 50 mL.
      NOTA: In alternativa, per piastre di Petri quadrate da 13 x 13 cm, è adatto lo strato inferiore e lo strato superiore da 40 mL; per piastre di Petri quadrate da 10 x 10 cm, è adatto lo strato inferiore da 25 ml e lo strato superiore di terreno.
   3. Lasciare indurire il terreno dello strato inferiore scoperto per 1 ora all'interno di una cappa a flusso laminare. Non disturbare le piastre di Petri quadrate mentre il mezzo si solidifica.
      NOTA: Durante l'indurimento dello strato inferiore, il mezzo dello sciame che non contiene induttori deve essere mantenuto in un'incubatrice a 65 °C o in un bagno d'acqua.
   4. Una volta che lo strato inferiore è completamente solidificato, rimuovere i coperchi e posizionare le piastre di Petri quadrate all'interno di una cappa a flusso laminare.
   5. Aggiungere 40 mL di terreno caldo dello strato superiore (50 °C) utilizzando una pipetta da 50 mL o una provetta da centrifuga da 50 mL.
      NOTA: Il mezzo dello strato superiore non contiene induttori.
   6. Polimerizzare le piastre a doppio strato sul piano di lavoro, coperte e indisturbate per 1 ora. Conservare le piastre preparate a 4 °C per un massimo di 24 ore.NOTA: Tempi di indurimento più lunghi ridurrebbero il contenuto di umidità e limiterebbero la motilità della sciamatura.

2. Crescita di E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1

1. Preparare 500 ml di LB di terreno aggiungendo 5 g di triptone, 5 g di NaCl e 2,5 g di estratto di lievito in ddH₂O e rabboccare la soluzione a 500 ml. Autoclavare la soluzione con ciclo liquido per 20 minuti a 121 °C e conservarla a 4 °C.
2. Preparare 100 mL di terreno LB-agar all'1,5% (p/v) aggiungendo 1 g di triptone, 1 g di NaCl, 0,5 g di estratto di lievito e 1,5 g di agar in ddH₂O e rabboccare la soluzione a 100 mL. Sterilizzare in autoclave la soluzione a ciclo liquido per 20 minuti a 121 °C. Trasferire il fluido in un bagno d'acqua a 50 °C per evitare che l'agar si solidifichi.
3. Quando il pallone di LB-agar è comodo da impugnare, aggiungere 20 ml di terreno di LB-agar in una piastra di Petri (10 cm di diametro) utilizzando una pipetta da 25 ml. Lasciare la piastra a temperatura ambiente per una notte e conservare la piastra LB-agar a 4 °C.
4. Effettuare l'inventario delle colture conservate a -80 °C, striare i ceppi di E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PAO1-YdeH su piastre di Petri LB-agar utilizzando anse di inoculazione monouso. Incubare le piastre di Petri capovolte per una notte a 37 °C.
5. Prelevare singole colonie per diversi ceppi dalle piastre di Petri, inoculare ciascuna colonia in 5 ml di terreno LB e incubare la coltura a 37 °C in un agitatore orbitale da laboratorio impostato a 220 giri/min.
6. Quando la densità di coltura raggiunge OD600nm ~1.0, rimuovere la coltura dall'agitatore e posizionarla a temperatura ambiente. Regolare la densità di coltura su OD600nm = 1.0, come descritto nel passaggio 3.2.1.

3. Inoculazione e incubazione di piastre a sciame a gradiente

1. Preparazione dei pozzetti di inoculazione
   NOTA: È possibile utilizzare modelli di copertura per la stampa 3D in grado di generare pozzi separati da una distanza standard al posto del metodo descritto di seguito.
   1. Segnare le posizioni dei pozzetti su carta A4, come mostrato nella Figura 1C. Impostare tre concentrazioni di prova in una piastra di Petri quadrata con due o tre repliche.
   2. Posizionare il foglio A4 contrassegnato sotto una piastra sfumata solidificata. Spingere il lato più largo di un puntale per pipetta da 100 μl nella superficie semisolida del mezzo nella posizione contrassegnata. Premere il puntale della pipetta fino a raggiungere la parte inferiore del mezzo dello strato superiore.
   3. Quando la punta tocca il fondo, non applicare alcuna forza verticale alla punta; Ruotare delicatamente la punta per isolare il contenuto del pozzetto cilindrico.
   4. Spostare orizzontalmente i puntali della pipetta lungo una distanza molto piccola per consentire il flusso d'aria nello spazio ristretto messo da parte. Premere il puntale con l'indice per bloccare il flusso di gas all'interno del puntale tenendo la pipetta con il pollice e il medio.
   5. Estrarre la punta verticalmente, mantenendo il contenuto del pozzetto nella punta mentre la si estrae.
      NOTA: Se il contenuto del pozzetto scivola, applicare una leggera pressione con il dito indice per sigillare completamente la punta.
   6. Ripetere i passaggi da 3.1.2 a 3.1.5 in ogni posizione contrassegnata. Coprire la piastra dello sciame prima dell'inoculazione.
2. Inoculazione e incubazione su piastra a gradiente
   1. Regolare la densità di coltura della crescita notturna su OD600nm = 1.0.
   2. Pipettare 80 μl della coltura di crescita notturna in ogni pozzetto. Non versare la coltura batterica al di fuori dei pozzetti.
   3. Avvolgere le piastre con pellicola sigillante. Per l'osservazione a lungo termine (3-5 giorni), avvolgere le piastre con nastro di gomma sterile da laboratorio.
      NOTA: È meno probabile che il nastro di gomma si rompa.
   4. Posizionare un becher riempito con ddH₂O nell'incubatrice per mantenere l'umidità all'interno dell'incubatrice. Incubare le piastre a sciame gradiente a 37 °C.
      NOTA: Non incubare le piastre dello sciame capovolte; Ciò causerà la fuoriuscita della coltura batterica dai pozzetti.
   5. Immagine della piastra dello sciame subito dopo l'inoculazione, registrandola come punto temporale di 0 ore.

4. Imaging della sciamatura superficiale batterica

1. Estrarre le piastre dello sciame, una alla volta, dall'incubatrice ogni 12 ore, tenendo la piastra orizzontalmente, e posizionarle nel sistema di imaging su gel (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Non lasciare impronte digitali sulla superficie delle lastre; Tenere il lato della piastra di sciame con guanti puliti.
2. Selezionare la modalità di imaging gel ; esporre la piastra dello sciame alla luce bianca; e regola la lunghezza focale per dare la visione più chiara degli sciami.
   NOTA: Utilizzare la stessa lunghezza focale per tutte le piastre di un determinato lotto.
3. Migliora la luminosità degli sciami per un'osservazione chiara regolando il tempo di esposizione a 300 ms. Regolare la soglia per ridurre al minimo l'interferenza della luce di sfondo.
   NOTA: La soglia viene regolata sull'interfaccia operativa del sistema di imaging su gel. Aumentare i valori a sinistra per ridurre al minimo l'interferenza della luce di fondo; Diminuisci i valori a destra per migliorare la luminosità degli sciami. In questo protocollo, la regione è solitamente compresa tra 6.000 e 50.000.
4. Salvare il file immagine per ulteriori analisi. Registra il tempo di imaging, il tipo di induttore, l'orientamento del gradiente e le deformazioni in un file .txt .

 

Tabella 1: Specifiche del mezzo sciame a doppio strato.

Strato superiore medio/brodo di lisogenesi (per 100 ml)
Triptone: 1 g
Cloruro di sodio: 1 g
Estratto di lievito: 0,5 g
Agar: 0,7 g
Terreno dello strato inferiore/terreno contenente induttore (per 100 ml)
Triptone: 1 g	Concentrazione di lavoro:	Concentrazione della soluzione madre:
Cloruro di sodio: 1 g
Estratto di lievito: 0,5 g	- Resveratrolo: 400 μM	- Resveratrolo: 100 mM
Agar: 0,7 g
Induttore:	- Arabinosio: 0,5% (p/v)	- Arabinosio: 20% (p/v)
- Soluzione madre di resveratrolo: 400 μL	o 1% (p/v)
- Soluzione madre di arabinosio: 2,5 mL o 5 mL

Risultati

Figura 1: Schema della preparazione, dell'inoculazione e dell'incubazione della piastra dello sciame a gradiente induttore. (A) Crescita notturna della coltura batterica a 37 °C. (B) Flusso di lavoro della piastra a sciame a gradiente indutt...

Materiali