Rilevamento colorimetrico della degradazione della corteccia durante la germinazione delle spore batteriche

Abstract

Fonte: Francis, M. B., et al. Rilevamento di frammenti di corteccia durante la germinazione delle spore batteriche. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra un metodo colorimetrico per rilevare la degradazione della corteccia durante la germinazione delle spore batteriche misurando il rilascio di zuccheri riducenti nel tempo. Utilizzando gli standard di N-acetilglucosamina e i campioni temporali, il test quantifica la concentrazione di zucchero attraverso una reazione cromogenica viola, indicando l'entità dell'idrolisi della corteccia.

Protocollo

1. Reagente colorante

1. Mentre i campioni sono sul ghiaccio, preparare il reagente colorante. Sciogliere 0,320 g di p-dimetilamminobenzaldeide (DMAB; reagente di Ehrlich) in 1,9 ml di acido acetico glaciale.
   Nota: Il reagente è sensibile al tempo, alla temperatura e alla luce e non deve essere preparato in anticipo.
2. Dopo che il DMAB si è completamente sciolto, aggiungere 100 μl di HCl 10 N e vortex.
3. Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale e vortex.

2. Reazione colorimetrica

1. Trasferire 100 μl di ciascun campione di corteccia raffreddato in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml.
2. Aggiungere 700 μl della soluzione colorante appena preparata a ciascun campione.
3. Trasferire immediatamente i campioni in un bagno d'acqua a 37 °C e incubare per ESATTAMENTE 20 minuti.
4. Trasferire 200 μl di ciascun campione in una piastra trasparente a 96 pozzetti.
5. Quantificare i campioni a 585 nm su un lettore di piastre. I campioni dovrebbero iniziare con un colore giallo e una reazione positiva si sposterà verso il viola. Più corteccia è presente, più profondo è il colore viola.

Materiali