Produzione e recupero di proteine ricombinanti da vescicole derivate da batteri

Abstract

Fonte: Streather, B. R., et al. Produzione e analisi ottimizzate di vescicole ricombinanti riempite di proteine da E. coli. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra la produzione e l'isolamento di proteine ricombinanti marcate con il peptide nucleante della vescicola (VNp) da vescicole batteriche. Un induttore innesca l'espressione della proteina marcata con VNp, guidando la formazione e l'incapsulamento delle vescicole, seguita dalla centrifugazione e dalla sonicazione per un recupero efficiente delle proteine senza lisi cellulare

Protocollo

1. Coltura cellulare batterica e induzione proteica

1. Per indurre l'espressione della proteina ricombinante dal promotore T7, aggiungere isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) a una concentrazione finale fino a 20 μg/mL (84 μM). L'induzione dell'espressione proteica ricombinante deve avvenire nella fase logaritmica tardiva (cioè densità ottica tipica, OD₆₀₀ di 0,8-1,0) per la produzione di vescicole. ​
   NOTA: La durata del periodo di induzione può variare tra le proteine, con alcune che raggiungono la massima produzione a 4 ore e altre durante la notte (18 ore). Ad oggi, la massima esportazione di vescicole è stata ottenuta nelle colture notturne.

2. Isolamento delle vescicole ricombinanti

1. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 3.000 x g (4 °C) per 20 min.
2. Per sterilizzare i terreni contenenti vescicole per la conservazione a lungo termine, far passare i terreni di coltura puliti attraverso un filtro in polietersulfone (PES) da 0,45 μm sterile e privo di detergenti.
   NOTA: Per verificare l'esclusione delle cellule vitali dal filtrato contenente vescicole, impiattare su agar brodo di lisogenia (LB) e incubare per una notte a 37 °C.
3. Per concentrare le vescicole in un volume più piccolo, passare il terreno sterile contenente vescicole attraverso un filtro sterile e privo di detergenti a base di esteri di cellulosa mista (MCE) da 0,1 μm.
4. Lavare delicatamente la membrana con 0,5-1 ml di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) utilizzando un raschietto cellulare o un divaricatore di plastica per rimuovere accuratamente le vescicole dalla membrana. Trasferire in un nuovo tubo per microfuge. ​
   NOTA: Le vescicole purificate possono essere conservate in terreno sterile o PBS a 4 °C. Ci sono esempi di proteine ricombinanti conservate in queste vescicole per 6 mesi, in questo modo, senza perdita di attività enzimatica.

3. Rilascio di proteine solubili da vescicole isolate

1. Una volta che le vescicole contenenti proteine sono state isolate nel terreno sterile/tampone, sottoporre le membrane lipidiche vescicolari alla sonicazione utilizzando un programma appropriato per l'apparato (ad esempio, 6 cicli di accensione e spegnimento da 20 s) e centrifugare a 39.000 x g (4 °C) per 20 minuti per rimuovere i detriti delle vescicole. NOTA: Lo shock osmotico o il trattamento con detergente possono essere utilizzati in alternativa per rompere le vescicole, ma è necessario considerare l'impatto sulla funzionalità delle proteine e/o sull'applicazione a valle.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	Melford	367-93-1
Brodo di lisogenia (LB) / LB agar	Stock da laboratorio	NA	10 g/L di triptone; 10 g/L di NaCl; 5 g/L di estratto di lievito (1,5 g/L di agar)
Filtro a membrana MF-Millipore (0,1 μm, MCE)	Merck	VCWP04700
Filtro a membrana Millipore Express PLUS (0,45 μm, PES)	Merck	HPWP04700
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Stock da laboratorio	NA