Trasferimento di plasmidi F e doppia selezione antibiotica in E. coli

Abstract

Fonte: Erdogan, F., et al., Saggi di accoppiamento coniugativo per l'analisi sequenziale specifica delle proteine di trasferimento coinvolte nella coniugazione batterica. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra la procedura per il trasferimento di un plasmide F da cellule di E. coli donatore a cellule ricevente utilizzando un plasmide di salvataggio e selezionando i transconiuganti attraverso la doppia resistenza agli antibiotici. Il processo include la miscelazione di colture batteriche, l'incubazione senza agitazione, l'interruzione delle coppie di accoppiamento e la placcatura su terreni selettivi per confermare il successo del trasferimento dei plasmidi.

Protocollo

1. Saggio di accoppiamento coniugativo da donatori XK1200 a riceventi MC4100

1. Preparare una coltura O/N di cellule XK1200 pOX38-Tc del gene Δgene::Cm + pK184 in 20 mL di brodo di lisogenia sterile (LB) con 20 μg/mL di cloramfenicolo (Cm), 50 μg/mL di kanamicina (Km) e cellule MC4100 in 5 mL di LB con 50 μg/mL di streptomicina (Sm) utilizzando cellule di uno stock di glicerolo o di una singola colonia su una piastra di agar e una pipetta sterile o un ansa. Coltiva le colture a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
2. Effettuare diluizioni 1:70 da ciascuna coltura O/N separatamente in 2 mL di LB sterile con gli stessi antibiotici. Aggiungere glucosio a una concentrazione finale di 100 mM a tutte le cellule del donatore. Far crescere le cellule fino alla fase di mid-log (OD₆₀₀ 0,5-0,7) a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
3. Centrifugare (4.000 x g per 5 minuti a 4 °C) per pellettare le cellule, scartare il surnatante, lavare una volta con LB sterile freddo per rimuovere gli antibiotici e risospendere le cellule in 2 mL di LB sterile freddo.
4. In duplicato, aliquotare 100 μL di ciascuna coltura in 800 μL di terreno LB sterile e lasciarli accoppiare a 37 °C per 1 ora senza agitare.
5. Agitare le celle per 30 s per interrompere le coppie di accoppiamento e posizionarle sul ghiaccio per 10 minuti per evitare ulteriori accoppiamenti.
6. Utilizzando la miscela vortexed e LB sterile fresco, preparare 6 diluizioni (da ^10-2 a ^10-7) dei transconiuganti. Selezionare per le cellule transconiuganti MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm individuando aliquote di 10 μL di ciascuna diluizione su ciascuna metà delle piastre di agar contenenti 50 μg/mL di Sm e 20 μg/mL di Cm, come nella Figura 1. Ripetere per entrambe le miscele duplicate. Mantieni l'area sterile e lavora vicino a una fiamma. Incubare le piastre O/N a 37 °C.

Risultati

Figura 1: Saggio di accoppiamento per valutare la funzione del gene bersaglio nella coniugazione. Le cellule donatrici e riceventi erano E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm trasformate rispettivamente con pK184-T...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di Petri	Fisher Scientifico	FB0875713
Antibiotici			Concentrazioni finali
cloramfenicolo (cm)	Fisher Scientifico	BP904-100	20 μg/mL
Kanamicina (Km)	BioBasic Inc.	DB0286	50 μg/mL
Streptomicina (Sm)	Fisher Scientifico	BP910-50	50 μg/mL