Inattivazione dei batteri mediante mononucleotide flavina attivato dalla luce

Abstract

Fonte: Cheng, C., et al. Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra un metodo per valutare gli effetti fototossici della flavina mononucleotide (FMN) sui batteri patogeni. Le colture batteriche sono esposte a concentrazioni crescenti di FMN e illuminate con luce visibile per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS) che danneggiano i componenti cellulari. I batteri sopravvissuti vengono quindi quantificati per valutare la riduzione dose-dipendente della vitalità.

Protocollo

1. Vitalità dello Staphylococcus aureus (S. aureus) dopo la fotolisi FMN (Figura 1)
   1. Trasmettere una colonia di S. aureus (BCRC 10451) da una piastra coltivata in 10 mL di brodo di lisogenia prelevato in una provetta da 15 mL con tappo a vite. Coltura in agitatore a 37°C per 16 h.
   2. Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere acqua sterilizzata nella provetta da centrifuga per diluire la coltura a una densità ottica di 0,5 a 600 nm (OD₆₀₀) (~6 x 10⁷ unità formanti colonie [CFU]/mL).
   3. Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL, centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante per ottenere un pellet cellulare.
   4. Aggiungere 1 mL di Riboflavina-5'-fosfato (o flavina mononucleotide; Soluzione tamponata FMN) (30, 60 e 120 μM FMN in tampone fosfato di potassio [PB]) ai pellet cellulari ottenuti come al punto 1.3 e vortex. Per il controllo irradiato, aggiungere 1 mL di PB da solo.
   5. Trasferire 1 mL di soluzioni cellulari batteriche vitali contenenti 30 μM di FMN e PB da soli in provette di vetro e irradiarle con luce viola a 10 W/m² per 30 minuti.
   6. Trasferire 1 mL di soluzioni cellulari batteriche vitali contenenti 30, 60 e 120 μM FMN e PB da soli in provette di vetro e irradiarle con luce blu a 20 W/m² per 120 minuti. Preparare un'altra provetta di vetro con 1 mL di soluzione di cellule batteriche vitali contenente 120 μM di FMN e irradiarla con luce blu a 20 W/m² per 60 minuti.
   7. Installare le provette come descritto nei passaggi 1.5 e 1.6 e coprirle con un foglio di alluminio spesso. Questi tubi fungono da controlli oscuri.
   8. Conservare la camera di irradiazione (così come i controlli al buio) in una cella frigorifera a 9 ± 1 °C durante il periodo di irradiazione di 30-120 minuti.
      NOTA: Il calore rilasciato dalle luci a diodi emettitori di luce (LED) non può essere ignorato, poiché i chip LED posizionati all'interno della tazza possono riscaldare il sistema di fotoreazione durante gli esperimenti di irradiazione. Gli esperimenti sono stati quindi condotti in una cella frigorifera mantenuta a 9 ± 1 °C.
   9. Dopo l'irradiazione, trasferire 0,2 mL da ciascuna delle soluzioni di reazione su una piastra di agar Luria (LA). Distribuire i batteri sulla piastra con una bacchetta di vetro a forma di L e incubare per una notte a 37 °C.
   10. Calcolare la conta vitale su piastra e i tassi di inattivazione di S. aureus dopo la crescita notturna.

NOTA: Il tasso di inattivazione di S. aureus è calcolato come la riduzione percentuale, che è pari a [1 -I/D] ×100%, dove I e D denotano, rispettivamente, il numero di CFU nel campione irradiato e nel controllo al buio. La percentuale di riduzione è definita come un valore negativo del tasso di inattivazione.

Risultati

Figura 1: Effetto della fotolisi FMN sulla vitalità di S. aureus.La percentuale di riduzione è definita come un valore negativo del tasso di inattivazione per S. aureus trattato con (A

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Luci LED blu, verdi e rosse	Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan		CC 12 V 5050
Dimetilsolfossido	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Termometro a infrarossi	Raytek Co. Santa Cruz, CA	MT4
Brodo LB	Difco Co., NJ
L-Metionina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
A partire da NBT	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Alimentatore	China tech Co., nuova città di Taipei, Taiwan	YP30-3-2
Riboflavina 5′-fosfato	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
RNasi	New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Contatore di energia solare	Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centro di raccolta e ricerca sulle biorisorse (BCRC), Hsinchu, Taiwan	10451
Spettrometro ottico UV-Vis	Ottica oceanica, Dunedin, FL	USB4000
Spettrofotometro UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, Giappone	U-2900
LED viola	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Cina