Quantificazione dell'inattivazione batterica indotta dalla luce attraverso la generazione di specie reattive dell'ossigeno

Abstract

Fonte: Cheng, C., et al. Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).

In questo video, una miscela di reazione tamponata contenente L-metionina, nitro blu tetrazolio (NBT) e flavina mononucleotide (FMN) viene irradiata con luce viola per indurre la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Ciò porta all'inattivazione batterica e alla formazione di formazan spettrometricamente rilevabile.

Protocollo

1. Rilevamento di specie reattive dell'ossigeno (O₂•⁻) in Staphylococcus aureus

1. Preparare i campioni di Staphylococcus aureus .
2. Diluire la densità batterica dei campioni con acqua sterilizzata a una densità ottica di 0,5 a 600 nm (OD (densità ottica)₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU (unità formante colonia) /mL). Trasferire 0,5 mL di coltura in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante per ottenere un pellet cellulare.
3. Aggiungere 0,1093 g di L-metionina, 0,1 g di NBT (cloruro di nitro blu tetrazolio) e 25 ml di FMN (flavina mononucleotide) (400, 240 o 120 μM) a 75 ml di PB (tampone fosfato). Per ogni 1 mL di reagente applicato, le concentrazioni finali di FMN, metionina e NBT sono rispettivamente 100 (60 o 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M e 1,2 × ^10-3 M.
4. Aggiungere 1 mL di ciascuna soluzione reagente (cioè con concentrazioni variabili di FMN) ai pellet cellulari ottenuti. Irradiare le soluzioni con luce viola a 10 W/m² per 10 min.
5. Centrifugare la miscela a 14.000 x g per 10 minuti e decantare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) per estrarre la NBT ridotta. Rilevare le specie di O₂•⁻ prodotte dall'assorbanza a 560 nm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dimetilsolfossido	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Termometro a infrarossi	Raytek Co. Santa Cruz, CA	MT4
Brodo LB	Difco Co., NJ
L-Metionina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT (Cloruro di nitro blu tetrazolio)	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Alimentatore	China tech Co., nuova città di Taipei, Taiwan	YP30-3-2
Riboflavina 5′-fosfato	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774
Contatore di energia solare	Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centro di raccolta e ricerca sulle biorisorse (BCRC), Hsinchu, Taiwan	10451
Spettrometro ottico UV-Vis	Ottica oceanica, Dunedin, FL	USB4000
Spettrofotometro UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokyo, Giappone	U-2900
LED viola	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Cina