Determinazione dell'efficacia antibatterica di una striscia polimerica caricata con antibiotici

Abstract

Fonte: Sekar, A., et. al., Un nuovo metodo per determinare l'attività antibatterica longitudinale dei materiali a rilascio di farmaco. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra un test basato sulla luminescenza per valutare l'efficacia antibatterica di una striscia polimerica caricata con antibiotici quantificando la luminescenza guidata da ATP, che diminuisce nelle colture batteriche esposte all'antibiotico.

Protocollo

Configurazione dello studio dell'attività antibatterica dipendente dal tempo

1. Coltivare i batteri per una notte in 1 ml di brodo TSB (brodo di soia triptico).
2. Diluire la sospensione batterica coltivata durante la notte a^10,5 CFU/mL in MHB sterile (brodo di Mueller-Hinton) e verificare la conta batterica vitale utilizzando le unità di luminescenza prima di iniziare l'esperimento.
3. Posizionare le strisce vergini UHMWPE (polietilene ad altissimo peso molecolare) e UHMWPE caricate con farmaci (3 mm x 5 mm x 10 mm) all'interno di una siringa da 3 ml.
4. Aspirare MHB contenente^10,5 CFU/mL nella siringa attraverso l'ago inserito fino al segno di 1,5 mL, che equivale a 1,35 mL di MHB (Figura 1: Passaggio 1).
5. Posizionare la siringa in un'incubatrice con agitazione (100 giri/min) a 37 °C fino ai punti temporali indicati: 6 ore, Giorno 1, Giorno 2, Giorno 3, Giorno 4, Giorno 5, Giorno 6 e Giorno 7 (Figura 1: Passaggio 2).
6. In ogni momento indicato, estrarre la siringa ed eseguire un test di vitalità microbica in tempo reale su 100 μL di sospensione batterica (Figura 1: Fase 3-4).
   1. Eseguire il test basato sulla luminescenza utilizzando piastre bianche opache a fondo opaco da 96 pozzetti.
   2. Miscelare 100 μl di sospensioni batteriche diluite con 100 μl di reagente per saggi.
   3. Mettere un coperchio coperto con un foglio di alluminio sulla piastra a 96 pozzetti preparata e incubare per 5 minuti a 100 giri/min agitando.
   4. Misurare immediatamente la luminescenza con un lettore di micropiastre utilizzando le seguenti impostazioni nel software Gen5 3.11.
      1. Fare clic su Nuovo per impostare un protocollo nella finestra Task Manager .
      2. Selezionare Costar 96 bianco opaco nel menu a discesa per Tipo di targa.
      3. Fare clic su Leggi nel menu Seleziona passaggi > azioni .
      4. Fare clic su Luminescenza nella finestra Metodo di lettura. Mantieni selezionate le opzioni Endpoint/cinetica e Luminescenza rispettivamente in Tipo di lettura e Tipo di ottica. Fare clic su OK.
      5. Mantenere le impostazioni nella finestra Read Step (guadagno = 135; tempo di integrazione = 1 sec; altezza di lettura = 4,5 mm). Fare clic su OK.
      6. Viene visualizzata la finestra del layout della piastra pronta per la seduta. Selezionare la casella Usa coperchio nella finestra della piastra di carico e fare clic su OK.
      7. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nella macchina per leggere i valori di luminescenza.
7. Determinare il numero di batteri vitali per i punti temporali 6 ore, giorno 1, giorno 2, giorno 3 e giorno 7. Determinare le CFU (unità formanti colonie)/mL dalle unità di luminescenza utilizzando la curva standard corrispondente.
8. Verificare l'assenza di batteri vitali nei campioni che hanno mostrato valori di luminescenza inferiori al limite di rilevabilità eseguendo il metodo spread-plate su piastre TSA (Tryptic soy agar) e incubando a 35 °C per una notte. Verificare la presenza di colonie il giorno successivo.
9. Centrifugare la sospensione batterica rimanente a 10.000 × g per 10 minuti e aspirare delicatamente il terreno esausto. Per le provette in cui i pellet non sono visibili a causa dell'attività antibatterica dei farmaci, lasciare 100 μl nella provetta per garantire che il pellet invisibile non venga disturbato (Figura 1: Fase 5).
10. Risospendere i batteri pellettati in MHB fresco e aspirare la sospensione batterica nella stessa siringa attraverso l'ago collegato (Figura 1: Passaggio 6).

Risultati

Figura 1: Una rappresentazione schematica della configurazione sperimentale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pannello ATCC 12600	Collezione di cultura dei tipi americani, VA, USA
Saggio di vitalità delle cellule microbiche BacTiter-Glo	Promega Corporation, Stati Uniti	G8231
BD Bacto Brodo di soia triptico (terreno digestivo di soia e caseina)	Becton-Dickinson, Stati Uniti	BD 211825	Acquistato da Fisher Scientific, USA
BD Luer-Lok Siringa sterile, monouso, 3 mL	BD, Stati Uniti	309657
Ago BD 5/8 in. monouso, sterile, 25 g	BD, Stati Uniti	305122
Terreni di coltura disidratati BD BBL: brodo Mueller Hinton II (aggiustato per cationi)	Becton-Dickinson, Stati Uniti	B12322	Acquistato da Fisher Scientific, USA
Terreni di coltura disidratati BD Difco: Agar di soia triptico (agar digesto di soia-caseina)	Becton-Dickinson, Stati Uniti	DF0369-17-6	Acquistato da Fisher Scientific, USA
Gentamicina solfato	Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, Cina
Incubatore con agitazione da banco LSE	Corning, NY, Stati Uniti
Lettore di piastre (Synergy H1	Biotek, VT, Stati Uniti
Agitatore Innova 2100	New Brunswick Scientific, NJ, Stati Uniti
UHMWPE	GUR1020, Celanese, TX, Stati Uniti
Vancomicina cloridrato	Fagron, Paesi Bassi	804148