Patterning microfluidico e tracciamento basato sulla fluorescenza della crescita batterica di singole cellule

Abstract

Fonte: Pioli, R., et al., Patterning di microrganismi e microparticelle attraverso l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra il metodo di cattura di singole cellule di Escherichia coli (E. coli) marcate in fluorescenza in trappole microfluidiche utilizzando una sospensione priva di carbonio e un flusso controllato, seguito dall'aggiunta di nutrienti per innescare la crescita e l'imaging a fluorescenza delle microcolonie.

Protocollo

1. Disegno batterico

Un giorno prima dell'esperimento, far crescere una popolazione di Escherichia coli (ceppo MG1655 prpsM-GFP). Inoculare la coltura direttamente dal brodo congelato e farla crescere per una notte per 20 ore in brodo di lisogenia (LB) in un incubatore a 37 °C. Aggiungere 50 μg/mL di kanamicina affinché le cellule mantengano il plasmide prpsM-GFP (proteina fluorescente verde).
Il giorno dell'esperimento, impostare l'incubatrice a scatola (Figura 1A) a 37 °C diverse ore prima dell'esperimento per garantire una temperatura uniforme e stabile prima di iniziare. Quindi, posizionare la pompa a siringa e la lastra di vetro riscaldata sul tavolino del microscopio (Figura 1B, C), impostando la temperatura alla stessa temperatura dell'incubatore a scatola.
NOTA: L'incubatore a scatola in cui è racchiuso l'intero sistema, compreso il microscopio (Figura 1E), assicura che venga mantenuta una temperatura uniforme e costante durante l'intero esperimento quando il canale viene lavato con il fluido.
Novanta minuti prima dell'esperimento, mettere il chip microfluidico in un recipiente riempito con etanolo al 100% (EtOH) e lavare il canale con EtOH al 100% per almeno 10 minuti. Mettere il chip microfluidico in un essiccatore sottovuoto e degassare per almeno 30 minuti. Sostituire l'EtOH con acqua distillata e trattare sottovuoto il truciolo per almeno 30 minuti. Mettere il chip microfluidico in forno a 70 °C per 10 min per rimuovere eventuali tracce di liquido rimaste nel canale.
NOTA: Questo passaggio è necessario per prevenire la formazione di bolle nel canale quando viene lavato con il terreno di coltura.
Pipettare 1 mL di terreno di acido 3-(N-morfolino)propansolfonico (MOPS) (1x) in un flaconcino da centrifuga e aggiungere 10 μL di fosfato di potassio 0,132 M (K₂HPO₄). Estrarre la coltura notturna dall'incubatore a 37 °C e aliquotare 100 μl nella fiala della centrifuga e centrifugare la coltura a 2.300 × g per 2 minuti. Pipettare delicatamente il surnatante dai flaconcini di centrifuga e risospendere il pellet in 1 mL di terreno MOPS fresco con 0,015% v/v di Tween 20 e 0,01% v/v di fosfato di potassio.
NOTA: La concentrazione tipica della sospensione batterica è compresa tra 0,015 e 0,15 vol%, il che garantisce la formazione di una zona di accumulo estesa e mobile e previene l'accumulo di particelle sul substrato. La sostituzione del terreno notturno con un terreno fresco riduce al minimo il rischio di rilasciare pellicole di batteri sul modello. La mancanza di una fonte di carbonio nel terreno fresco impedisce alle cellule di crescere nella sospensione durante la modellazione del modello. Una concentrazione dello 0,015% v/v di Tween 20 nella sospensione è necessaria affinché l'angolo di contatto del liquido che si ritira sulla dima PDMS rientri nell'intervallo ottimale, tra 30 e 60°.
Caricare la sospensione batterica in una siringa da 1 ml e collegare la siringa al chip attraverso un tubo microfluidico.
1. Per fissare il collegamento tra la siringa e il tubo, inserire direttamente un ago con un diametro esterno di 0,6 mm nel tubo. Per evitare di disperdere le sospensioni rimaste nelle vicinanze dell'ingresso attraverso il canale, sciacquare il fluido fresco attraverso il foro utilizzato come uscita durante il processo di modellatura (Figura 2A-III), piuttosto che il foro utilizzato come ingresso.
2. Montare la siringa sulla pompa a siringa e iniettare la sospensione nel chip microfluidico attraverso l'ingresso situato nella parte a monte del canale fino a quando la sospensione copre la regione del modello con trappole. NOTA: Durante il processo di iniezione del liquido, l'aria può fuoriuscire attraverso un'uscita situata all'estremità a valle del canale.
3. Impostare la pompa a siringa per prelevare la sospensione batterica (Figura 2A-I) ad una portata di 0,07-0,2 μL/min, che nella geometria descritta corrisponde a una velocità di arretramento del menisco di 80-100 μm/min.
4. Monitora il processo di patterning tramite il software del microscopio.
  NOTA: Qui, è stato utilizzato un ingrandimento 10x per monitorare il menisco che si ritira sul modello e un ingrandimento 20x è stato utilizzato per monitorare la deposizione di singoli batteri nelle trappole microfabbricate.
Una volta che il modello è stato modellato con le celle (Figura 2A-II), aumentare la portata di prelievo per svuotare rapidamente il canale microfluidico e lavarlo con LB fresco precedentemente degassato per almeno 30 minuti e preriscaldato a 30 °C.
Impostare la pompa a siringa a una portata di 2 μL/min per lavare delicatamente il canale. Una volta riempito il canale, aumentare la portata (15 μL/min) in base alle specifiche esigenze sperimentali.
Acquisisci immagini di batteri in crescita all'ingrandimento e all'intervallo di tempo desiderati.

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Risultati

Figura 1: Schema della piattaforma per l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità in un canale microfluidico. (A) Incubatrice a scatola. L'incubatore a scatola mantiene una temperatura uniforme e costante (in questo caso, 30 °C) all...