Saggio del biosensore batterico per la rilevazione del mercurio biodisponibile in condizioni anaerobiche

Abstract

Fonte: Stenzler, B. R. et. al., Un saggio di biosensore anaerobico per il rilevamento di mercurio e cadmio. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra l'uso di biosensori batterici geneticamente modificati per misurare con precisione la frazione biodisponibile degli ioni mercurio in condizioni anaerobiche. Variando la concentrazione di solfato di magnesio, il test garantisce che il biosensore risponda selettivamente agli ioni di mercurio liberi, come indicato dalle variazioni dell'intensità della fluorescenza.

Protocollo

1. Saggio di esposizione

1. Progettazione di un layout di targa.
   NOTA: Assicurarsi di aver calcolato tutti i valori di pipettaggio e di aver preparato le scorte prima di iniziare il test di esposizione. Come progettare correttamente un esperimento e quali controlli includere sono descritti in dettaglio nel testo. Inoltre, l'esperimento non deve essere avviato se c'è ossigeno nella camera anaerobica indicata sul monitor anaerobico.
2. Progetta il layout della piastra secondo un modello a 96 pozzetti. Ciò consentirà a 32 diversi trattamenti di eseguire esperimenti in repliche tecniche di 3, che è meglio rappresentato da una griglia 4 x 8 per impostare le fiale (vedi Figura 1).

NOTA: Quando si verifica il ruolo di una variabile sull'assorbimento di Hg con il biosensore inducibile al mercurio, sono necessari due trattamenti per ciascuna variabile: il trattamento (biosensore + mercurio (Hg) + variabile + nitrato) e il relativo bianco di trattamento (biosensore + variabile + nitrato). Quando si verifica il ruolo di una variabile sulla fisiologia della cellula utilizzando il biosensore costitutivo, sono necessari due trattamenti per ciascuna variabile: il trattamento (biosensore + Hg + variabile + nitrato) e il bianco di trattamento (biosensore + variabile + Hg). Il mercurio può essere sostituito con cadmio (Cd). Hg o Cd diventeranno la variabile quando si esegue una curva di calibrazione. Non è necessario che i biosensori costitutivi e inducibili vengano eseguiti contemporaneamente (nella stessa disposizione delle piastre). Nella Tabella 1 è riportato un esempio di modello per il layout della piastra e la corrispondente griglia 4 x 8 durante il test di un intervallo di concentrazione di magnesio (variabile).

2. Impostare la griglia 4 x 8 in base al layout della piastra del saggio.

1. Inserire i flaconcini standard di politetrafluoroetilene (PTFE) da 7 mL nel vassoio.
NOTA: Le fiale di PTFE devono essere lavate con acido o sterilizzate a caldo prima dell'uso. Devono essere maneggiati solo manipolando l'esterno del flaconcino.

2. A ciascun flaconcino, aggiungere il volume del mezzo di esposizione corrispondente a ciascun trattamento.
NOTA: In un'esposizione con un volume totale di 2.000 μL (2 mL), il mezzo di esposizione aggiunto sarà: mezzo di esposizione μL = 2.000 μL – trattamento (bianco) μL. (ad esempio, mezzo di esposizione μL = 2.000 – 100 μL (biosensore) – 40 μL (nitrato) – 100 μL (Hg) – 100 μL (variabile (ad es. solfato di magnesio, MgSO₄)) = 1660 μL). Assicurarsi che il volume aggiunto della variabile testata non superi il 5% (100 μL) del volume finale.

3. Aggiungere a ciascun flaconcino il volume corrispondente della soluzione della variabile chimica da testare, secondo la disposizione della piastra.

4. Aggiungere nitrato a ciascuna fiala in modo che la concentrazione finale sia di 200 μM (40-80 μL). Escludere questo passaggio per i bianchi di trattamento del biosensore costitutivo.

5. Aggiungere Hg (5 nM quando si esegue il test per una variabile) o Cd (300 nM quando si esegue il test per una variabile) alle fiale in base al layout della piastra. Escludere questo passaggio per i bianchi di trattamento dei biosensori inducibili al mercurio.

1. Quando si utilizza l'Hg, prendere il brodo da 4-8 μM e agitare bene. Diluire la soluzione nel mezzo di esposizione in un flaconcino di PTFE da 7 mL a 100-250 nM per ottenere una soluzione di Hg funzionante. Da questa soluzione di lavoro, aggiungere Hg alle fiale richieste. In questo caso, una curva di calibrazione di Hg compresa tra 0 e 12,5 nM.
NOTA: Quando si verifica l'effetto di una variabile sulla biodisponibilità di Hg o Cd, assicurarsi che l'[Hg] o il [Cd] rimangano costanti in tutti i trattamenti. Quando si aggiunge Hg o Cd, assicurarsi di utilizzare un puntale per pipetta, ma non toccare mai il mezzo di esposizione nelle fiale.

Agitare manualmente con un movimento orbitale.
NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa ora a seconda del tempo necessario per la speciazione di Hg o Cd in soluzione. Se lasciato per più di un'ora, posizionare i tappi in PTFE sulle fiale di PTFE per evitare l'evaporazione/contaminazione.

Pipettare delicatamente il Biosensor Stock avanti e indietro per garantire l'omogeneità. Aggiungere 100 μl di stock di biosensore a ciascuna fiala. Agitare orbitalmente manualmente.

Preparare il lettore di piastre al riscaldamento per la lettura con i seguenti criteri: temperatura a 37 °C, funzionamento cinetico per 10 ore con letture ogni 2,5-5 minuti con agitazione orbitale tra le letture e misure di fluorescenza con un'eccitazione di fluorescenza di 440 nm e un'emissione di 500 nm.

Pipettare 200 μl da ciascuna fiala di PTFE nella griglia 4 x 8 nei pozzetti corrispondenti della piastra a 96 pozzetti (micropiastre nere, 96-Well Clear-Bottom Nonbinding Surface Microplates). Pipettare avanti e indietro cinque volte prima di trasferire ogni 200 μl.NOTA: Invece di gettare il puntale della pipetta, lasciare il puntale della pipetta nella fiala di PTFE per tenere traccia dell'avanzamento del pipettaggio.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel vassoio del lettore di piastre, quindi posizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e iniziare il saggio.

 

Tabella 1: Un esempio di layout della piastra per l'utilizzo del biosensore per testare la biodisponibilità di Hg (5 nM) su un gradiente di magnesio (0-10 mM)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

un

Biosensore indotto da Hg + Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biosensore indotto da Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biosensore costitutivo + Hg + Nitrato + 0 mM Mg

Biosensore costitutivo + Hg + 0 mM Mg

b

Biosensore indotto da Hg + Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biosensore indotto da Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biosensore costitutivo + Hg + Nitrato + 0,1 mM Mg

Biosensore costitutivo + Hg + 0,1 mM Mg

c

Biosensore indotto da Hg + Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biosensore indotto da Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biosensore costitutivo + Hg + Nitrato + 1 mM Mg

Biosensore costitutivo + Hg + 1 mM Mg

d

Biosensore indotto da Hg + Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biosensore indotto da Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biosensore costitutivo + Hg + Nitrato + 10 mM Mg

Biosensore costitutivo + Hg + 10 mM Mg

Materiali