Screening degli inibitori della pirofosfatasi legata alla membrana batterica mediante un test colorimetrico

Abstract

Fonte: Vidilaseris, K., et al. Screening per gli inibitori della pirofosfatasi legati alla membrana di Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un test colorimetrico per lo screening degli inibitori della pirofosfatasi batterica legata alla membrana (mPPasi) quantificando il rilascio di ortofosfato. Il metodo consente l'identificazione di composti che inibiscono la mPPasi da Thermotoga maritima, un potenziale bersaglio farmacologico antimicrobico.

Protocollo

1. Reagenti per la preparazione del saggio

1. Preparare la soluzione di arsenito-citrato.
   1. Pesare 5 g di arsenito di sodio e 5 g di citrato trisodico diidrato.
      CAUTELA: L'arsenito di sodio è tossico; Pertanto, utilizzare dispositivi di protezione adeguati e maneggiare con particolare cura. Per precauzione, non maneggiare prima di aver letto e compreso tutte le precauzioni di sicurezza necessarie. Maneggiare solo in una cappa aspirante per non inalare polvere/vapori del composto o delle sue soluzioni. In caso di inalazione, spostarsi all'aria aperta e consultare un medico. Indossare occhiali di sicurezza chimica, guanti protettivi e indumenti adeguati per evitare l'ingestione e il contatto con occhi/pelle. In caso di ingestione, chiamare immediatamente un centro antiveleni o un medico. Se viene a contatto con la pelle o negli occhi, lavare abbondantemente con acqua e consultare un medico.
   2. Sciogliere in 100 ml di acqua.
   3. Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale, mescolare e aggiungere acqua a 250 ml.
   4. Conservare a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
      NOTA: La soluzione è stabile per più di un anno.
2. Preparare la soluzione A e la soluzione B.
   1. Per la soluzione A, aggiungere 10 ml di HCl 0,5 M (acido cloridrico) ghiacciato a 0,3 g di acido ascorbico. Sciogliere l'acido ascorbico agitandolo.
   2. Per la soluzione B, aggiungere 1 mL di acqua ghiacciata a 70 mg di eptamolibdato di ammonio tetraidrato e agitare per sciogliere.
      NOTA: Conservare entrambe le soluzioni in ghiaccio fino al momento dell'uso. Per garantire la coerenza del risultato del test, entrambe le soluzioni possono essere conservate in ghiaccio per un massimo di una settimana.
3. Preparare lo standard del fosfato (Pi) con la concentrazione di 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM per la calibrazione.
   1. Aggiungere 0 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL di 5 mM Na₂HPO₄ (fosfato disodico) diidrato a quattro microprovette contenenti 370 μL della miscela di reazione.
   2. Rabboccare fino a 1 ml con acqua.

2. Saggio di attività per una piastra a 96 pozzetti

NOTA: Vedere la Figura 1 per il flusso di lavoro schematico del saggio.

1. Aggiungere 1 mL di soluzione B a 10 mL di soluzione A, mescolare a vortice e conservare la soluzione in ghiaccio.
   NOTA: Questa soluzione dovrebbe essere trasparente e gialla. Conservare la soluzione A + B in ghiaccio per almeno 30 minuti prima dell'uso. Tuttavia, utilizzare la soluzione entro 3 ore poiché andrà a male dopo una conservazione a lungo termine.
2. Aggiungere 40 μL di 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM Pi standard alle strisce di provette in triplicato utilizzando una pipetta multicanale.
   NOTA: La miscela di reazione senza Pi greco aggiunto verrà utilizzata come bianco.
3. Aggiungere 25 μl di soluzione composta alle strisce di provette utilizzando una pipetta multicanale.
   NOTA: Ogni composto ha tre diverse concentrazioni in triplicato, il che è sufficiente per la stima iniziale della concentrazione inibitoria semimassima (IC50). Per una determinazione più accurata dell'IC50, è possibile utilizzare otto diverse concentrazioni di composti. Per l'enzima non inibito, la soluzione composta viene sostituita con una quantità uguale di acqua. Come controlli positivi sono stati utilizzati 2,5 μM, 25 μM e 250 μM di sale sodico imidodifosfato (IDP).
4. Aggiungere 15 μl di miscela di soluzione di mPPasi (pirofosfatasi legata alla membrana) alle strisce di provette (ad eccezione delle provette contenenti lo standard Pi) utilizzando una pipetta multicanale.
5. Sigillare le strisce di tubo con un foglio sigillante adesivo. Tagliare il foglio sigillante per separare ogni striscia di tubo.
6. Pre-incubare i campioni per 5 minuti a 71 °C. Posizionare i campioni sul blocco riscaldante con un intervallo di 20 s tra ogni striscia per ridurre al minimo il consumo di tempo durante le fasi successive.
7. Per ogni striscia, aprire la guarnizione adesiva. Aggiungere 10 μl di 2 mM di pirofosfato di sodio bibasico utilizzando una pipetta multicanale e mescolare pipettando su e giù per 5×. Sigillare nuovamente la striscia di tubo utilizzando la stessa guarnizione.
   NOTA: Questo passaggio potrebbe inizialmente essere difficile da realizzare in 20 secondi; Tuttavia, diventerà più facile dopo alcuni test.
8. Incubare a 71 °C per 5 min.
9. Posizionare i campioni sull'apparecchio di raffreddamento con un intervallo di 20 s tra ogni striscia. Lasciarli raffreddare per 10 minuti, ma centrifugare brevemente ogni striscia dopo 5 minuti di raffreddamento, per travasare le gocce d'acqua sotto il foglio sigillante, quindi rimetterlo nell'apparecchio di raffreddamento e rimuovere la sigillatura.
   NOTA: L'apparato di raffreddamento può essere realizzato semplicemente posizionando una piastra PCR (reazione a catena della polimerasi) a 96 pozzetti su una piastra di Petri in polistirene (dimensioni 150 mm × 15 mm) riempita con acqua e congelata per almeno 1 ora. L'apparecchio deve essere estratto dal congelatore circa 5 minuti prima dell'inizio del test. Non estrarre l'apparecchio di raffreddamento subito prima del raffreddamento del campione poiché congelerà la miscela di reazione e ostacolerà lo sviluppo del colore.
10. Dopo 10 minuti di raffreddamento, aggiungere 60 μL di soluzione A + B, mescolare pipettando su e giù per 5× e mantenere le strisce di provette sull'apparecchio di raffreddamento per 10 minuti.
11. Aggiungere 90 μl della soluzione di arsenito-citrato e mantenere a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per produrre un colore blu stabile.
    CAUTELA: A causa della sua tossicità, tutte le soluzioni contenenti arsenito di sodio devono essere maneggiate sempre con la massima cura. Pertanto, l'aggiunta di una soluzione di arsenito e citrato deve essere eseguita in una cappa aspirante.
12. Erogare 180 μl di ciascuna miscela di reazione in una micropiastra di polistirene trasparente a 96 pozzetti.
13. Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 860 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.

Risultati

Figura 1: Un flusso di lavoro schematico del saggio di inibizione della TmPPasi in un formato di piastra a 96 pozzetti. La numerazione rossa mostra le fasi del test secondo il protocollo, mentre le frecce blu mostrano l'ordine degli interval...

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