Visualizzazione delle proteine di germinazione nella membrana interna delle spore batteriche

Abstract

Fonte: Wen, J., Pasman, et. al., Visualizzazione dei germinosomi e della membrana interna nelle spore di Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'uso della microscopia a illuminazione strutturata per acquisire immagini tridimensionali a fluorescenza che rivelano l'organizzazione delle proteine di germinazione all'interno della spora batterica.

Protocol

1. Imaging delle proteine di germinazione (tempo: 1 ora)
   1. Cattura le immagini di trasmissione e fluorescenza delle spore e di una miscela di microsfere fluorescenti modificate con carbossilato rosso e giallo-verde su un microscopio a illuminazione strutturata (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo a olio 100x (apertura numerica = 1,49), una fotocamera CCD (Charge-Coupled Device) e un software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali). Genera tutte le immagini a temperatura ambiente senza il disturbo della luce ambientale. Assicurarsi di pulire sempre l'obiettivo 100x e il vetrino con etanolo al 75% prima di eseguire l'imaging.
   2. Concentrati su microsfere fluorescenti da 100 nm (diametro) e ottimizza la funzione di diffusione del punto (psf) regolando l'anello di correzione sull'obiettivo 100x fino a ottenere una psf simmetrica, riducendo così al minimo la sfocatura dell'immagine. La psf è la risposta all'impulso o la risposta di un sistema di imaging a una sorgente puntiforme o a un oggetto puntiforme.
   3. Selezionare un campo visivo con circa 10 microsfere fluorescenti rotonde. Applicare una regolazione della messa a fuoco del reticolo per le lunghezze d'onda di eccitazione di 561 nm e 488 nm come guida per il software di analisi delle immagini.
   4. Focalizza le spore con la luce di trasmissione e cattura un'immagine della luce di trasmissione nella modalità media di 16× con esposizioni di 200 ms per ogni immagine.
   5. Cattura immagini fluorescenti grezze 3D-SIM delle spore con la modalità di illuminazione "3D-SIM", le impostazioni della fotocamera in modalità di lettura Guadagno di moltiplicazione elettronica (EM) 10 MHz a 14 bit e guadagno EM a 175. Eccita la sonda FM4-64 nelle spore PS4150 con luce laser a 561 nm al 20% di potenza laser e un tempo di illuminazione di 400 ms.
   6. Eccita GerKB-mCherry e GerD-GFP nelle spore KGB80 con, rispettivamente, luce laser a 561 nm al 30% di potenza laser per 1 s e luce laser a 488 nm al 60% di potenza laser per 3 s. Le impostazioni di Z-Stack sono in modalità dall'alto verso il basso, 0,2 μm/passo.
      NOTA: Questi parametri laser sono stati applicati per garantire un valore massimo di luminosità di circa 4.000 per la finestra dell'istogramma.

Materials