Visualizzazione delle proteine di germinazione nella membrana interna delle spore batteriche

Abstract

Fonte: Wen, J., Pasman, et. al., Visualizzazione dei germinosomi e della membrana interna nelle spore di Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra l'uso della microscopia a illuminazione strutturata per acquisire immagini tridimensionali a fluorescenza che rivelano l'organizzazione delle proteine di germinazione all'interno della spora batterica.

Protocollo

1. Imaging delle proteine di germinazione (tempo: 1 ora)
   1. Cattura le immagini di trasmissione e fluorescenza delle spore e di una miscela di microsfere fluorescenti modificate con carbossilato rosso e giallo-verde su un microscopio a illuminazione strutturata (vedi Tabella dei materiali) dotato di un obiettivo a olio 100x (apertura numerica = 1,49), una fotocamera CCD (Charge-Coupled Device) e un software di analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali). Genera tutte le immagini a temperatura ambiente senza il disturbo della luce ambientale. Assicurarsi di pulire sempre l'obiettivo 100x e il vetrino con etanolo al 75% prima di eseguire l'imaging.
   2. Concentrati su microsfere fluorescenti da 100 nm (diametro) e ottimizza la funzione di diffusione del punto (psf) regolando l'anello di correzione sull'obiettivo 100x fino a ottenere una psf simmetrica, riducendo così al minimo la sfocatura dell'immagine. La psf è la risposta all'impulso o la risposta di un sistema di imaging a una sorgente puntiforme o a un oggetto puntiforme.
   3. Selezionare un campo visivo con circa 10 microsfere fluorescenti rotonde. Applicare una regolazione della messa a fuoco del reticolo per le lunghezze d'onda di eccitazione di 561 nm e 488 nm come guida per il software di analisi delle immagini.
   4. Focalizza le spore con la luce di trasmissione e cattura un'immagine della luce di trasmissione nella modalità media di 16× con esposizioni di 200 ms per ogni immagine.
   5. Cattura immagini fluorescenti grezze 3D-SIM delle spore con la modalità di illuminazione "3D-SIM", le impostazioni della fotocamera in modalità di lettura Guadagno di moltiplicazione elettronica (EM) 10 MHz a 14 bit e guadagno EM a 175. Eccita la sonda FM4-64 nelle spore PS4150 con luce laser a 561 nm al 20% di potenza laser e un tempo di illuminazione di 400 ms.
   6. Eccita GerKB-mCherry e GerD-GFP nelle spore KGB80 con, rispettivamente, luce laser a 561 nm al 30% di potenza laser per 1 s e luce laser a 488 nm al 60% di potenza laser per 3 s. Le impostazioni di Z-Stack sono in modalità dall'alto verso il basso, 0,2 μm/passo.
      NOTA: Questi parametri laser sono stati applicati per garantire un valore massimo di luminosità di circa 4.000 per la finestra dell'istogramma.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini in vetro essiccati all'aria	Menzel Gläser	630-2870
Obiettivo olio APO TIRF N20R8 100× (NA=1.49)
Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Microsfere modificate con carbossilato FluoSpheres	Invitrogeno, 0,1 μm	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientifico	F34653
Mezzo di gradiente di densità non ionica di Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158
Immagine J
Telecamera CCD iXON3 DU-897 X-6515	Tecnologia Andor		https://imagej.net/Welcome
Software di imaging per microscopio	Nikon, Giappone	Elemento NIS AR 4.51.01
Acqua demineralizzata ultrapura MilliQ	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Microscopio Nikon Eclipse Ti
Vetrini coprioggetti di precisione	Paul Marienfeld	117650
Provette con tappo a vite 50 mL	Thermo Fisher Scientifico		Nunc TM