Trasfezione di ameba wild-type tramite elettroporazione con supporto per l'alimentazione batterica

Abstract

Fonte: Paschke, P., et al. Ingegneria genetica delle cellule di Dictyostelium discoideum basata sulla selezione e la crescita sui batteri. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra la procedura per l'introduzione di un plasmide che trasporta un gene bersaglio nelle cellule dell'ameba tramite elettroporazione, seguita dal recupero in un integratore batterico per consentire un'efficiente somministrazione genica nell'ameba wild-type.

Protocollo

1. Impostazione delle celle Dictyostelium per la trasfezione
   1. Coltivare Klebsiella aerogenes fino alla confluenza in SM (latte scremato) terreno (terreno ricco di sostanze nutritive) durante la notte a RT (temperatura ambiente). Le colture possono essere conservate per un massimo di 2 settimane a 4 °C.
   2. Aggiungere circa 400 μL di questa sospensione batterica su una piastra di agar SM (peptone 10 g/L; estratto di lievito 1 g/L; glucosio 10 g/L; KH₂PO₄ 1,9 g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 g/L; MgSO₄ anidro 0,49 g/L; 1,7% agar) e distribuirla uniformemente. Prelevare un'ansa sterile e inoculare con cellule di Dictyostelium . Allargare le celle su un bordo della piastra.
   3. Incubare la piastra a 22 °C per 2 giorni per garantire zone di crescita sufficientemente ampie per la trasfezione.
      NOTA: Per i ceppi di Dictyostelium che non creano grandi zone di crescita (ad esempio, Ax3, DH1 o JH10), o per gli sperimentatori inesperti, utilizzare invece piastre di pulizia.
   4. Prelevare un'ansa sterile e inoculare con cellule di Dictyostelium (circa 2-4 x 10⁵ cellule). Trasferire le cellule a 800 μl di una sospensione densa di K. aerogenes in SM. Mescolare le cellule pipettando su e giù.
   5. Trasferimento di 400 μl, 200 μl, 100 μl e 50 μl su piastre di agar SM fresche. Aggiungere a ogni piastra 400 μl di sospensione aggiuntiva di SM K. aerogenes , distribuire uniformemente e asciugare.
   6. Incubare le piastre a 22 °C per circa 2 giorni fino a quando le piastre diventano traslucide.
      NOTA: A causa del loro tasso di crescita più rapido, i batteri producono inizialmente un prato confluente e le amebe successivamente "ripuliscono" il piatto dai batteri. Il tempo necessario per questo processo può variare a seconda del background del ceppo e della capacità delle cellule mutanti di crescere sui batteri.

2. Trasfezione di cellule di Dictyostelium basata sulla selezione batterica

1. Per preparare le piastre con la sospensione di K. aerogenes , aggiungere 10 mL di tampone SorMC contenente batteri K. aerogenes a una densità di OD (densità ottica) ₆₀₀ = 2 (aggiungere 200 μL della soluzione madre preparata OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes per la concentrazione batterica desiderata) in una capsula di Petri trattata con coltura tissutale da 10 cm.
   NOTA: Questa piastra è successivamente necessaria per coltivare le cellule trasfettate di D. discoideum . In alternativa, è possibile utilizzare una piastra per colture tissutali a 6 pozzetti. Nel caso della trasfezione dei plasmidi extracromosomici, la piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti è più efficiente in termini di risorse. Utilizzare 2 mL di sospensione di K. aerogenes SorMC (OD₆₀₀ = 2) per pozzetto.
2. Preparazione delle cellule di Dictyostelium
   1. Utilizzando un circuito di inoculazione monouso da 10 μl, raschiare le cellule dalle zone di crescita (circa 3 cm) della piastra di coltura (bordo dell'area liberata) o della piastra di pulizia. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di tampone H40 ghiacciato.
      NOTA: La tempistica della raccolta delle cellule dalle piastre di compensazione è fondamentale. La raccolta troppo precoce produce una quantità insufficiente di cellule, mentre la raccolta troppo tardiva aumenta il rischio di produrre cellule parzialmente sviluppate.
   2. Lavare le celle centrifugando per 2 minuti a 1.000 x g o centrifugando per 2 s a 10.000 x g. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nel tampone H40 fino a una densità finale di 2-4 x 10⁷ cellule/mL. Mantenere le cellule fredde durante l'intera procedura di trasfezione. Utilizzare un impasto liquido di acqua ghiacciata per garantire il contatto diretto dei tubi e del ghiaccio.
3. Elettroporazione
   1. Aggiungere 100 μL di cellule in una provetta con 1-2 μg di DNA (acido desossiribonucleico). Mescolare accuratamente pipettando su e giù.
   2. Trasferire la miscela cellula/DNA in una cuvetta di elettroporazione pre-raffreddata (distanza di 2 mm).
   3. Pulsare le celle utilizzando le seguenti impostazioni di onda quadra: 350 V, 8 ms, 2 impulsi e intervallo di impulsi di 1 s.
      NOTA: Non aggiungere più di 2 μg di DNA. Quantità più elevate sono tossiche per le cellule e diminuiscono l'efficienza di trasfezione. Il volume totale di DNA aggiunto non deve superare i 5 μl.
   4. Trasferire immediatamente le cellule nella piastra di Petri da 10 cm preparata in precedenza con K. aerogenes SorMC e lasciare che le cellule si riprendano per 5 ore.
      NOTA: Controllare le cellule nella capsula di Petri al microscopio invertito. Le cellule appariranno rotonde subito dopo l'elettroporazione, ma torneranno alla loro forma ameboide dopo circa 30 minuti, quando avranno avuto abbastanza tempo per attaccarsi correttamente alla superficie.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microcentrifughe Eppendorf 5424/5424R	TermoScientifico	05-400-002
Centrifughe Eppendorf 5702R con rotore modello A-4-38	TermoScientifico	12823252
Armadio di sicurezza Foruna - SCANLAF	Labogene
Biofotometro Plus	Eppendorf
CLSM 710	Zeiss
Agar purificato	Ossoide	LP0028
Brodo SM	Formedium	SMB0102
2x libbra di brodo	Formedium	LBD0102
Acido libero HEPES	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	P/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	Sigma Aldrich	442909
Acido folico	Sigma Aldrich	F7876
KOH	VWR	26668.263
Piatto per coltura tissutale stile 100 x 20 mm, trattato per coltura tissutale	Corning Incorporated	353003
Cuvette per elettroporazione con distanza di 2 mm, elettrodo lungo	Flusso genetico limitato	E6-0062
10 μl Ansa di inoculazione, blu 10 micro l	TermoScientifico	129399
Spandiconcime, a forma di L, sterile	Greiner Bio-One	730190