Visualizzazione delle interazioni batteriche a singola cellula

Abstract

Fonte: Yarringto, K. D., et al. Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a singola cellula. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video mostra la preparazione di un sistema di cocoltura utilizzando batteri mobili e non mobili sotto un tampone di agarosio per l'imaging di cellule vive. Mostra come i batteri mobili rilevano attrattivi chimici e invadono le colonie non mobili, rivelando interazioni batteriche.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule batteriche e tamponi di inoculazione

1. Misurare la densità ottica, OD₆₀₀, di ciascuna sottocoltura e diluire Pseudomonas aeruginosa a_{OD 600} = 0,03 e Staphylococcus aureus a_{OD 600} = 0,10 in M8T (Minimum Medium 8 + triptone) preriscaldato a 37 °C. Mescolare P. aeruginosa e S. aureus in un rapporto 1:1 e vortex.
   NOTA: Se i ceppi richiedono antibiotici, possono essere aggiunti alla notte e alla sottocoltura, ma non devono essere aggiunti quando si mescolano le specie per l'imaging se influenzano le altre specie nella cocoltura. La stabilità del plasmide e gli effetti degli antibiotici su tutte le specie nella cocoltura dovranno essere determinati per ogni organismo/plasmide utilizzato.
2. Pipettare uniformemente 1 μL di cocoltura sul fondo di un vetrino coprioggetti sterile e preriscaldato da 35 mm.
3. Rimuovere il ritaglio in silicone dallo stampo utilizzando una pinzetta sterile.
4. Rimuovere il tampone dal piatto utilizzando spatole sterili.
   1. Infilare la spatola leggermente piegata sotto il bordo del tampone tenendo lo stampo capovolto per farlo cadere su un coperchio sterile della piastra di Petri.
      NOTA: Non forzare l'estrazione del tampone, altrimenti si strapperà. Tieni traccia di quale lato del pad è il fondo.
5. Trasferire il tampone nel piatto con le cellule batteriche, con il lato inferiore rivolto verso il basso, facendo scorrere la spatola angolata a 90° sotto il tampone e posizionandola sopra il vetrino coprioggetti inoculato. Utilizzare la spatola angolata a 90° per fare in modo che il tampone sia a filo contro il vetrino coprioggetti e spingere delicatamente fuori eventuali bolle d'aria.
6. Rimuovere l'umidità in eccesso dalle salviettine umidificate e posizionarle attorno al bordo del piatto, assicurandosi che non tocchino il pad. Il campione è ora pronto per l'imaging.

Materiali