Arricchimento di lipoproteine batteriche mediante separazione di fase con detergente non ionico

Abstract

Fonte: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Arricchimento di lipoproteine batteriche e preparazione di lipopeptidi N-terminali per la determinazione strutturale mediante spettrometria di massa. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra l'arricchimento delle lipoproteine batteriche utilizzando un detergente non ionico che subisce la separazione di fase al riscaldamento. Attraverso sbalzi di temperatura sequenziali e fasi di centrifugazione, le lipoproteine vengono selettivamente suddivise nella fase detergente, mentre i contaminanti non lipoproteici vengono rimossi. Le lipoproteine arricchite vengono quindi precipitate, lavate e risospese per applicazioni a valle.

Protocollo

1. Arricchimento di lipoproteine mediante partizionamento di fase Triton X-114 (TX-114)

1. Integrare il lisato batterico con tensioattivo TX-114 a una concentrazione finale del 2% (vol/vol) aggiungendo un volume uguale di tensioattivo al 4% (vol/vol) in soluzione salina con tampone Tris/acido etilendiamminotetraacetico (TBSE) e incubare su ghiaccio per 1 ora, mescolando per inversione ogni ~15 minuti.
   NOTA: Una volta raffreddati, il surnatante e il tensioattivo saranno miscibili.
2. Trasferire la provetta in un bagno d'acqua a 37 °C e incubare per 10 minuti per indurre la separazione di fase. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per mantenere la separazione bifasica.
3. Pipettare delicatamente la fase acquosa superiore e gettarla. Aggiungere il TBSE ghiacciato alla fase inferiore del tensioattivo per riempire il tubo al suo volume originale e capovolgerlo per mescolare. Incubare con ghiaccio per 10 min.
4. Trasferire la provetta in un bagno d'acqua a 37 °C e incubare per 10 minuti per indurre la separazione di fase, quindi centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Ripetere ancora una volta i passaggi 1.3-1.4 per un totale di 3 separazioni. Rimuovere la fase acquosa superiore e gettarla.
6. Rimuovere il pellet di proteine precipitate che si è formato durante il corso delle estrazioni (visibile sul fondo del tubo), aggiungendo 1 volume di TBSE ghiacciato alla fase tensioattiva. Centrifugare a 4 °C a 16.000 x g per 2 minuti per pellettare proteine insolubili.
   NOTA: Il campione deve rimanere in un'unica fase. Se si verifica la separazione di fase, raffreddare nuovamente il campione e centrifugare nuovamente. Il pellet è generalmente composto da contaminanti non lipoproteici, ma può essere conservato per ulteriori analisi.
7. Trasferire immediatamente il surnatante in una provetta da microcentrifuga fresca da 2,0 ml contenente 1250 μl di acetone al 100%. Pipettare accuratamente su e giù per lavare il campione dal puntale poiché sarà viscoso. Mescolare per inversione e incubare per una notte a -20 °C per far precipitare le proteine.
8. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente in lipoproteine in pellet con attenzione all'orientamento della provetta. Le lipoproteine formeranno un sottile film bianco lungo la parete esterna del tubo.
9. Lavare il pellet due volte con acetone al 100%. Decantare l'acetone e lasciare asciugare il campione all'aria.
10. Aggiungere 20-40 μl di Tris-cloridrato da 10 mM, pH 8,0 o un tampone campione Laemmli SDS-PAGE standard e risospendere accuratamente pipettando su e giù contro la parete con le lipoproteine precipitate. Raschiare il lato del tubo con la punta della pipetta per rimuovere le lipoproteine.
    NOTA: Le lipoproteine non si dissolvono nel tampone Tris, ma formano una sospensione.
    1. Conservare le lipoproteine a -20 °C fino al momento dell'uso.

Materiali