Purificazione delle proteine del dominio P ricombinante derivate da batteri del norovirus umano

Abstract

Fonte: Leuthold, M. M., et al. Produzione di domini sporgenti di norovirus umano in E. coli per cristallografia a raggi X. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video dimostra la purificazione del dominio P del norovirus umano ricombinante utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale, evidenziando la separazione della proteina bersaglio dalle impurità a peso molecolare più alto e più basso in base all'accessibilità differenziale dei pori. Il processo è monitorato mediante assorbanza UV e confermato attraverso l'analisi SDS-PAGE delle frazioni eluite.

Protocollo

1. 3° Fase di Purificazione

1. Lavare le pompe e le tubazioni del sistema di purificazione HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni) e pre-equilibrare la colonna SEC (cromatografia ad esclusione dimensionale) (vedi Lista Materiali) con GFB (Gel filtration buffer).
2. Iniettare il dominio P nella colonna a una velocità di flusso di 1 ml/min utilizzando un superloop (fino a 12 ml) o un loop (fino a 3 ml), a seconda del volume del campione concentrato. Al termine dell'iniezione, aumentare la portata a 2,5 ml/min.
3. All'aumentare dell'OD (densità ottica) e al distacco del dominio P dalla colonna, raccogliere frazioni di 1,5 ml. Controllare le frazioni utilizzando SDS-PAGE con un gel al 12% (Figura 1A e 1B). Raggruppare solo le frazioni più pure e concentrare a ~ 3 mg/ml e ~ 8 mg/ml.
   Nota: Dopo ~110 ml (volume vuoto), la maggior parte delle impurità viene eluita da una colonna SEC con volume del letto di 320 ml. Il dominio P è solitamente eluito come dimero. Il tempo/volume di eluizione del dimero del dominio P dipende dal grado di preparazione (pg) della colonna SEC.

Risultati

Figura 1. Risultati schematici e rappresentativi per la 3a fase di purificazione.
Cromatogramma dell'eluizione del dominio P utilizzando SEC e corrispondente risultato SDS-PAGE. I numeri neri indicano le frazioni che vengono raccolte.

Materiali