Purificazione selettiva di una proteina batterica mediante cromatografia a scambio ionico negativo

Abstract

Fonte: Kuo, T., et al. Purificazione cromatografica negativa in un'unica fase della proteina attivante i neutrofili Helicobacter pylori sovraespressa in Escherichia coli in modalità batch. J. Vis. Exp. (2016)

Il video mostra una tecnica di cromatografia negativa per purificare una proteina associata alla virulenza da un lisato batterico. Utilizzando una resina caricata positivamente in una soluzione tamponata, le proteine della cellula ospite vengono trattenute selettivamente, mentre la proteina bersaglio quasi neutra rimane non legata e viene raccolta nel flusso. Questo metodo consente una separazione e un recupero efficienti della proteina bersaglio per le applicazioni a valle.

Protocollo

1. Espressione di HP-NAP ricombinante in Escherichia coli (E. coli)

1. Preparare il plasmide pET42a-NAP contenente la sequenza di DNA della proteina attivante i neutrofili Helicobacter pylori (HP-NAP) del ceppo H. pylori 26695 come descritto in precedenza. Preparare i plasmidi contenenti la sequenza di DNA di HP-NAP con le mutazioni puntiformi desiderate.
2. Trasformare 10 ng dei suddetti plasmidi di DNA in cellule competenti per E. coli BL21 (DE3) mediante shock termico per 45 secondi a 42 °C, strisciare le cellule su piastre di agar con brodo di lisogenesi (LB) contenenti 50 μg/ml di kanamicina e incubare le piastre a 37 °C per 16 ore.
3. Inoculare singole colonie in provette individuali contenenti 5 ml di brodo LB con 50 μg/ml di kanamicina e coltivarle in precoltura a 37 °C per 16 ore con agitazione a 170 giri/min.
4. Inoculare 2 ml delle cellule di precoltura di cui sopra in 200 ml di brodo LB contenente 50 μg/ml di kanamicina in un pallone da 1 L. Incubare il pallone di coltura inoculato a 37 °C per 2 ore agitando a 170 giri/min fino a quando l'assorbanza a 600 nm raggiunge circa 0,4-0,5 rilevati da uno spettrofotometro ultravioletto-visibile (UV/VIS).
5. Aggiungere 80 μl di 1 M isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) nella coltura di cui sopra a una concentrazione finale di 0,4 mM per indurre l'espressione di HP-NAP. Incubare la coltura per 3 ore fino a quando l'assorbanza a 600 nm raggiunge circa 1,6-1,7.
6. Centrifugare le celle a 6.000 x g a 4 °C per 15 minuti per rimuovere il surnatante. Conservare il pellet di cella a -70 °C fino alla purificazione.

2. Preparazione della frazione proteica solubile contenente HP-NAP

NOTA: Tutti i passaggi seguenti vengono eseguiti a 4 °C.

1. Risospendere 50 ml del pellet cellulare preparato nella fase 1.6 del protocollo in 20 ml di Tris-HCl 20 mM, pH 9,0, 50 mM di NaCl contenente 0,13 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), 0,03 mM di N-alfa-tosil-L-lisinil-clorometilchetone (TLCK) e 0,03 mM di N-tosil-L-fenillaninil clorometilchetone (TPCK) a 4 °C come descritto in precedenza.
2. Disgregare le cellule batteriche facendo passare la sospensione batterica attraverso un omogeneizzatore ad alta pressione azionato a una distanza compresa tra 15.000 e 20.000 psi per 7 volte a 4 °C.
3. Centrifugare il lisato cellulare a 30.000 × g a 4 °C per 1 ora per separare le frazioni proteiche solubili e insolubili utilizzando un'ultracentrifuga. Trasferire il surnatante come frazione proteica solubile in un becher.
4. Misurare la concentrazione proteica della frazione proteica solubile con il metodo Bradford utilizzando un kit commerciale con albumina sierica bovina (BSA) come standard, secondo le istruzioni del produttore.
5. Aggiungere 177,6 μl di HCl 1 N in 20 ml della frazione proteica solubile ottenuta dalla fase 2.3 del protocollo per regolarne il valore di pH da pH 9,0 a pH 8,0.
6. Aggiungere 20 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM di NaCl alla soluzione proteica di cui sopra per ottenere la concentrazione proteica finale di 0,5 mg/ml.

3. Purificazione di HP-NAP ricombinante da E. coli mediante cromatografia batch in modalità negativa con resine a scambio ionico DEAE

1. Preparare 15 ml di resine dietilamminoetilico (DEAE).
   1. Pesare 0,6 g di polvere secca di resine DEAE e sospenderla in 30 ml di 20 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM di NaCl a temperatura ambiente per almeno 1 giorno.
   2. Centrifugare la resina a 10.000 x g a 4 °C per 1 minuto.
   3. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
   4. Aggiungere 15 ml di Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM.
   5. Ripetere i passaggi del protocollo da 3.1.2 a 3.1.4 altre quattro volte.
   6. Conservare i 15 ml di resina stabilizzata (50% di impasto liquido in 30 ml di tampone Tris) a 4 °C per un uso successivo.
      NOTA: Tutti i passaggi seguenti vengono eseguiti a 4 °C.
2. Aggiungere 45 ml delle proteine solubili preparate nella fase del protocollo da 2,6 a 15 ml di resina e mescolare l'impasto proteico/resinoso con un agitatore magnetico a 4 °C per 1 ora.
3. Versare l'impasto proteico/resinoso in una colonna di plastica o di vetro dotata di rubinetto. Lasciare che la resina si depositi per gravità.
4. Aprire il rubinetto per consentire alla soluzione proteica di scorrere attraverso la colonna per gravità fino a quando il livello del liquido nella colonna non è appena sopra la resina. Raccogliere il flusso come frazione non legata, che contiene l'HP-NAP purificato.
5. Aggiungere 15 ml di Tris-HCl 20 mM ghiacciato, pH 8,0, 50 mM NaCl nella colonna.
6. Aprire il rubinetto per consentire al tampone di lavaggio di scorrere attraverso la colonna per gravità fino a quando il livello del liquido nella colonna non si trova appena sopra la resina. Raccogliere il flusso come frazione di lavaggio.
7. Ripetere i passaggi del protocollo da 3.5 a 3.6 altre quattro volte per raccogliere le frazioni di lavaggio aggiuntive.

Materiali