Una procedura per la purificazione di una proteina marcata con poliistidina da Streptococcus mutans

Abstract

Fonte: Murata, T., et al. Purificazione di una proteina ad alta massa molecolare in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra una procedura passo-passo per la purificazione di una proteina marcata con poliistidina secreta da Streptococcus mutans.

Protocollo

1. Concentrare le proteine del surnatante di coltura mediante precipitazione del solfato di ammonio.
   NOTA: Estrarre dai corpi cellulari se una proteina bersaglio è intracellulare.
   1. Centrifugare la sospensione di coltura batterica (Streptococcus mutans) per 20 minuti a 10.000 x g a 4 °C. Recuperare il surnatante di coltura in un becher di vetro da 3 L.
   2. Aggiungere 1.122 g di solfato di ammonio a 2 L di surnatante (saturazione dell'80%) agitando energicamente con un agitatore magnetico. Lasciare formare il precipitato per almeno 4 ore a 4 °C mescolando.
      NOTA: La formazione di precipitati può essere continuata durante la notte.
   3. Centrifugare la soluzione precipitata con solfato di ammonio a 15.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante.
   4. Raccogliere il precipitato con una spatola e trasferirlo in un becher di vetro da 200 mL. Risospendere i pellet in 35 mL di tampone legante (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 5 mM imidazolo, pH 8,0).
   5. Dializzare la sospensione con 2.500 mL di tampone legante utilizzando un tubo per dialisi in cellulosa rigenerata, a 4 °C, agitando. Sostituire la soluzione di dialisi dopo 2 ore e continuare la dialisi durante la notte.
   6. Sostituire nuovamente la soluzione di dialisi. Continuare a dializzare per altre 2 ore.
2. Centrifugare la sospensione dialitizzata a 20.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Filtrare il surnatante attraverso un filtro a membrana utilizzando un'apparecchiatura di filtrazione ad aspirazione. Trasferire il filtrato in un pallone da 75 cm² .
3. Frazionare la glucosiltransferasi-SI (GTF-SI) marcata con poliistidina dalla sospensione filtrata mediante cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC).
   1. Trasferire 2 mL di impasto resinoso IMAC caricato con Ni (circa 1 mL di resina) in una colonna cromatografica la cui uscita è fissata su una provetta di silicone. Rimuovere la soluzione di stoccaggio mediante il flusso per gravità.
      CAUTELA: Non lasciare che la resina si asciughi durante l'IMAC.
   2. Aggiungere 3 ml di acqua distillata nella colonna per lavare la resina. Aggiungere 5 mL di tampone legante per equilibrare la resina.
   3. Chiudere il flusso con un rubinetto a pizzico Hoffmann. Aggiungere 5 mL della sospensione filtrata dal passaggio 2 per preparare l'impasto.
   4. Aggiungere tutto il liquame alla sospensione filtrata rimanente. Far roteare delicatamente il composto per 30 minuti a 4 °C.
   5. Caricare nuovamente la miscela sulla colonna. Rimuovere la sospensione per gravità. Lavare la resina IMAC con 20 mL di tampone legante.
      NOTA: Regolare la portata a circa 2 mL/min con un rubinetto a pizzico Hoffmann durante il successivo IMAC.
   6. Eluire il GTF-SI ricombinante con 20 mL di tampone di eluizione (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM imidazolo, pH 8,0).
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. L'eluato deve essere conservato a 4 °C. La resina IMAC può essere riutilizzata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Unità di ultrafiltrazione centrifuga	Sartorius	VS2032	Sostituzione del tampone e concentrazione proteica
Centrifuga	Kubota	7780II
Colonna cromatografica	Bio-Rad	7321010	Per IMAC
Pinza per membrana per dialisi	Marchio Fisher	21-153-100
Tubi per dialisi	Come uno	2-316-06
Imidazolo	Wako	095-00015	Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione
Incubatrice	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Impostazione della temperatura: 37 °C
Microcentrifuga	Kubota	3740
Cloruro di sodim	Wako	191-01665	Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione
Sodio diidrogeno fosfato diidrato	Wako	192-02815	Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione
Idrossido di sodio	Wako	198-13765	Preparazione del tampone di legame e del tampone di eluizione
Solfato di ammonio	Wako	015-06737	Precipitazione del solfato di ammonio
Resina caricata con Ni-charge	Bio-Rad	1560133	Per IMAC
Filtro a membrana	Merck Millipore	JGWP04700	Diametro 0,2 μm