Misurazione del legame del farmaco al caseo dalle lesioni tubercolari tramite il metodo della dialisi a equilibrio rapido

Abstract

Fonte: Sarathy, J. P. et al. Un test in vitro di legame del caseo che prevede la penetrazione del farmaco nelle lesioni della tubercolosi. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra un test in vitro per misurare il legame del farmaco al caseo dalle lesioni della tubercolosi utilizzando la dialisi rapida all'equilibrio. Descrive i passaggi per la preparazione delle sospensioni del caseo, l'esecuzione della dialisi e il calcolo della frazione del farmaco non legata per prevedere la penetrazione del farmaco nel caseo.

Protocollo

1. Dosaggio di dialisi a rapido equilibrio (RED)

1. Stoccare 6,5 μL della soluzione da 500 μM del composto in esame in 643,5 μL dell'omogenato per ottenere la concentrazione finale di 5 μM (≤1% DMSO) e vortex.
2. Posizionare gli inserti ROSSI nella piastra di base. Aggiungere 200 μl della matrice addizionata con farmaco nella camera donatrice (anello rosso) di ciascun inserto RED e 350 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in ciascuna camera ricevente. Preparare 3 inserti per ogni composto in esame (campioni triplicati). Sigillare la piastra con una piastra adesiva e incubare a 37 °C sul termomiscelatore a 200 giri/min (1 x g) per 4 ore.
3. Dopo l'incubazione, mescolare delicatamente il contenuto delle camere donatrice e ricevente pipettando su e giù 2-3 volte. Pipettare 20 μL di aliquote di omogenato dalle camere donatrici e aggiungerle a 20 μL di PBS pulito in una provetta da 1,5 mL (1:1). Allo stesso modo, pipettare 20 μL di aliquote di campioni PBS dalle camere del ricevitore e aggiungere a 20 μL di omogenato pulito (corrispondenza della matrice).
   NOTA: La corrispondenza della matrice elimina la necessità di creare 2 curve di calibrazione separate (in omogeneizzato e PBS) per l'analisi quantitativa. Il contenuto della camera donatrice può sedimentare nel tempo. Miscelare delicatamente il contenuto pipettando prima di rimuovere le aliquote.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di base riutilizzabile per dispositivo Pierce RED	Fisher Scientifico	Codice: PI-89811
Inserti per dispositivi Pierce RED, 50/scatola	Fisher Scientifico	Codice: PI-89809
Strumento di rimozione dell'inserto Pierce RED	Fisher Scientifico	89812
Guarnizione adesiva della piastra	Fisher Scientifico	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)	Tecnologie per la vita	10010-049
DMSO	Sigma	472301