Microscopia microfluidica time-lapse per studiare la persistenza degli antibiotici nei batteri

Abstract

Fonte: Oms, T., et al. Analisi di popolazione e a singola cellula della persistenza degli antibiotici in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video presenta un protocollo per il monitoraggio di singole cellule batteriche che esprimono una proteina legante il DNA marcata in fluorescenza all'interno di un sistema microfluidico. Illustra come gli antibiotici inibiscono la maggior parte delle cellule, mentre una sottopopolazione di cellule persistenti sopravvive al trattamento e ricresce dopo la rimozione dell'antibiotico.

Protocol

Imaging al microscopio time-lapse microfluidico

NOTA: La sezione seguente descrive la preparazione della piastra microfluidica, nonché la procedura di acquisizione e analisi delle immagini in time-lapse. Lo scopo di questo esperimento è quello di osservare e analizzare il fenotipo di persistenza dopo il trattamento antibiotico a livello di singola cellula. I dati raccolti durante questo esperimento possono essere utilizzati per generare un'ampia gamma di risultati a seconda della domanda affrontata e/o dei reporter fluorescenti utilizzati durante l'esperimento. Nell'esperimento qui descritto, è stata effettuata un'analisi quantitativa della lunghezza cellulare e della fluorescenza HU-mCherry, che riflette l'organizzazione nucleoide nelle cellule persistenti e non persistenti.

1. Colture cellulari batteriche per microscopia time-lapse microfluidica
   1. Inoculare 5 mL di terreno (acido 3-[N-morfolino] propansulfonico (MOPS) glicerolo 0,4%, integrato con un antibiotico selettivo se necessario) con una colonia isolata in una provetta di vetro (≥25 mL) e posizionare la provetta in un incubatore con agitazione impostata a 37 °C e 180 giri/min durante la notte (tra 15 h e 19 h).
   2. Il giorno successivo, misurare il diametro esterno_{di 600} nm e diluire la coltura in un terreno fresco aggiustato per la temperatura (37 °C, glicerolo MOPS 0,4%) in una provetta di vetro fino a un diametro esterno finale di₆₀₀ nm di ~0,001. Lasciare crescere la coltura per una notte (tra le 15 e le 19 ore) in un incubatore vibrante a 37 °C e 180 giri/min per ottenere una coltura in fase esponenziale precoce il giorno successivo.
2. Preparazione della piastra microfluidica e imaging al microscopio time-lapse
   NOTA: Gli esperimenti microfluidici possono essere eseguiti in dispositivi microfluidici disponibili in commercio (come descritto qui) o in sistemi microfluidici prodotti internamente.
   1. Rimuovere la soluzione di conservazione (se presente) da ogni pozzetto della piastra microfluidica e sostituirla con un terreno di coltura fresco.
      NOTA: Se la piastra microfluidica contiene un pozzetto di uscita dei rifiuti, la soluzione di conservazione del pozzetto di uscita deve essere rimossa ma non sostituita dal fluido.
   2. Sigillare la piastra microfluidica con il sistema manifold facendo clic sul pulsante Seal o tramite il software microfluidico (selezionare prima Strumento, seguito da Piastra di tenuta).
      NOTA: Per sigillare la piastra, è necessario applicare una pressione uniforme alla piastra e al collettore premendo manualmente la piastra contro il collettore. Se eseguita correttamente, la nota "sigillato" dovrebbe apparire sull'interfaccia ONIX2. È importante non esercitare alcuna pressione sul vetrino per evitare qualsiasi potenziale rischio di rottura del collettore.
   3. Una volta sigillato, eseguire una prima sequenza di adescamento (fare clic su Esegui sequenza di adescamento liquido sull'interfaccia del software microfluidico).
      NOTA: La sequenza di adescamento del liquido corrisponde a 5 minuti di perfusione a 6,9 kPa per i pozzi 1-5, seguiti da 5 minuti di perfusione a 6,9 kPa per il pozzo 8 e da un giro di perfusione finale per il pozzo 6 per 5 minuti a 6,9 kPa. La Run Liquid Priming Sequence consente la rimozione della soluzione di conservazione che può essere ancora presente nei canali di collegamento tra i diversi pozzetti.
   4. Incubare la piastra in una camera termostatica del microscopio alla temperatura desiderata (qui, 37 °C) per un minimo di 2 ore prima dell'inizio dell'imaging al microscopio.
   5. Avviare una seconda sequenza di adescamento del liquido prima di iniziare l'esperimento.
   6. Sigillare la piastra microfluidica facendo clic su Sigilla sull'interfaccia del software microfluidico. Sostituire il terreno nel pozzetto 1 e nel pozzetto 2 con 200 μL di terreno fresco, nel pozzetto 3 con 200 μL di terreno fresco contenente l'antibiotico (qui, ofloxacina (OFX) a 5 μg·mL⁻¹), nel pozzetto 4 e nel pozzetto 5 con 200 μL di terreno fresco, nel pozzetto 6 con 200 μL di terreno fresco, e nel pozzetto 8 con 200 μL del campione di coltura (dalla fase 1.2) diluito a un OD₆₀₀ nm di 0,01 nel terreno fresco.
   7. Sigillare la piastra microfluidica come descritto al punto 2.2 e posizionarla sull'obiettivo del microscopio all'interno dell'armadio del microscopio.
      NOTA: Assicurarsi di posizionare una goccia di olio da immersione sull'obiettivo del microscopio prima di posizionare la piastra microfluidica.
   8. Nel software microfluidico, fare clic su Caricamento cella per consentire il caricamento della cella nella piastra microfluidica.
      NOTA: La fase di caricamento delle celle comprende 15 s di perfusione a 13,8 kPa per il pozzo 8, seguiti da 15 s di perfusione a 27,6 kPa per il pozzo 6 e il pozzo 8 e un round finale di perfusione per il pozzo 6 per 30 s a 6,9 kPa. La densità delle cellule nella piastra microfluidica è fondamentale per l'esperimento. La prima parte di questo protocollo microfluidico consiste nella crescita di batteri per 6 ore in un terreno fresco prima del trattamento antibiotico. Dopo 6 ore di crescita, la densità cellulare deve essere sufficiente per rilevare le rare cellule persistenti (nelle condizioni utilizzate in questo studio, le cellule persistenti generano a una frequenza di ^10-4). Se la densità cellulare è troppo elevata, è difficile distinguere le singole cellule, il che impedisce un'analisi precisa delle singole cellule. Poiché il tasso di crescita dipende direttamente dal terreno, la densità delle cellule nei campi di microscopia deve essere valutata prima di iniziare l'esperimento.
   9. Impostate una messa a fuoco ottimale utilizzando la modalità a luce trasmessa e selezionate diverse regioni di interesse (ROI) in cui viene osservato un numero di celle appropriato (fino a 300 celle per campo).
      NOTA: Seleziona almeno 40 ROI per assicurarti che le celle persistenti rare vengano visualizzate.
   10. Sul software microfluidico, fare clic su Crea un protocollo. Programmare l'iniezione di terreno fresco a 6,9 kPa per 6 ore (pozzetto 1-2), seguita dall'iniezione del terreno contenente l'antibiotico a 6,9 kPa per 6 ore (pozzetto 3) e, infine, l'iniezione di terreno fresco a 6,9 kPa per 20 ore (pozzetti 4-5).
       NOTA: Una coltura batterica diluita a un OD₆₀₀ nm di 0,01 consente ai batteri di crescere nella camera microfluidica per 6 ore, assicurando che le cellule siano nella fase di crescita esponenziale. A seconda del numero di cellule introdotte nel dispositivo microfluidico durante la fase di caricamento (vedi passaggio 2.8), la durata della fase di crescita può essere adattata per ottenere fino a 300 cellule per ROI. Poiché la persistenza è un fenomeno raro, l'aumento del numero di cellule per ROI migliora la possibilità di osservare le cellule persistenti. Il numero di cellule, tuttavia, non deve superare le 300 celle per ROI, poiché ciò rende noiosa l'analisi di singole cellule.
   11. Esegui l'imaging al microscopio in modalità time-lapse con un fotogramma ogni 15 minuti utilizzando la luce trasmessa e la sorgente di luce di eccitazione per il reporter fluorescente. In questo caso, è stata utilizzata una sorgente luminosa di eccitazione a 560 nm per il segnale mCherry (LED da 580 nm al 10% di potenza con filtro 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] e 100 ms di esposizione per mCherry). Per l'imaging cellulare è stato utilizzato il software Zen3.2 compatibile con Zeiss.
3. Analisi delle immagini
   NOTA: L'apertura e la visualizzazione delle immagini al microscopio vengono eseguite con il software open-source ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/). L'analisi quantitativa delle immagini viene eseguita utilizzando il software open-source ImageJ/Fiji e il plug-in gratuito MicrobeJ (https://microbej.com). In questo protocollo è stata utilizzata la versione MicrobeJ 5.13I(14).
   1. Aprire il software ImageJ/Fiji sul computer e trascinare le immagini di microscopia time-lapse hyperstack nella barra di caricamento Fiji. Usa Immagine > Colore > Crea composito per fondere i diversi canali dell'hyperstack. Se i canali dell'esperimento time-lapse non corrispondono al colore desiderato (ad esempio, il contrasto di fase viene visualizzato in rosso anziché in grigio), utilizzare Image > Color > Arrange Channels per applicare il colore appropriato ai canali.
   2. Apri il plug-in MicrobeJ e rileva le cellule batteriche utilizzando l'interfaccia di modifica manuale. Elimina le celle rilevate automaticamente e delinea manualmente le celle persistenti di interesse fotogramma per fotogramma.
      NOTA: È possibile utilizzare diverse impostazioni per rilevare automaticamente le singole celle. In questo caso è stato utilizzato il rilevamento manuale poiché le cellule persistenti analizzate formano filamenti lunghi, che raramente vengono rilevati correttamente utilizzando il rilevamento automatico.
   3. Dopo il rilevamento, utilizzare l'icona Risultato nell'interfaccia di modifica manuale di MicrobeJ per generare una tabella ResultJ. Salva il file ResultJ e utilizzalo per ottenere informazioni dettagliate su diversi parametri di interesse nell'analisi di singole cellule. In questo protocollo, sono state esportate la fluorescenza media dell'intensità di HU-mCherry, la lunghezza cellulare e l'area cellulare delle singole cellule.

Materials