Screening di modulatori di-GMP ciclici utilizzando batteri che esprimono una proteina reporter fluorescente

Abstract

Fonte: Rugjee, K. N., et al. Istituzione di una configurazione ad alto rendimento per lo screening di piccole molecole che modulano la segnalazione c-di-GMP in Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra lo screening di modulatori di-GMP ciclici utilizzando batteri geneticamente modificati che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di un promotore sensibile al c-di-GMP. La fluorescenza viene misurata in una piastra a più pozzetti contenente diversi composti di prova. I composti che inibiscono la produzione di c-di-GMP portano a una riduzione della fluorescenza. I dati vengono quindi analizzati per identificare potenziali modulatori della segnalazione c-di-GMP nei batteri.

Protocollo

1. Generazione di proteina fluorescente verde (GFP) etichettata come di-GMP ciclico (c-di-GMP) Ceppo Pseudomonas aeruginosa

1. Inoculare 5 ml di terreno di brodo lisogenico (LB) con una singola colonia di P. aeruginosa e incubare per una notte a 37 °C agitando a 200 giri/min.
2. Trasferire 2 ml di coltura notturna in 200 ml di terreno LB fresco in un pallone da 1 L e incubare a 37 °C agitando a 200 giri/min.
3. Monitorare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) ogni 30 minuti prelevando un campione da 1 ml dal pallone ed esaminandolo con uno spettrofotometro.
4. Quando l'OD₆₀₀ raggiunge un valore compreso tra 0,3 e 0,5, inserire 40 ml di coltura in una provetta da centrifuga conica da 50 ml.
5. Pellettare le celle centrifugando a 8.000 giri/min per 10 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 40 ml di soluzione di saccarosio ghiacciata, sterile, da 300 mM.
6. Pellettare le cellule una seconda volta centrifugando come descritto al punto 1.5 e risospendere in 20 ml di soluzione di saccarosio ghiacciata, sterile, da 300 mM.
7. Pellettare le celle un'ultima volta centrifugandole come descritto al punto 1.5 e risospendere in 400 μl di soluzione di saccarosio ghiacciata, sterile, 300 mM.
   Nota: la densità cellulare a questo punto dovrebbe essere di circa 1 x 10¹¹ unità formanti colonie per millilitro (UFC/ml).
8. Raffreddare le celle con ghiaccio per 30 minuti, dopodiché sono pronte per l'elettroporazione.
9. Aggiungere 1 μl di una soluzione plasmidica di 0,2 μg/μl di pCdrA::gfp^C a 40 μl di cellule elettrocompetenti di P. aeruginosa preparate sopra in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml pre-raffreddata con ghiaccio. Miscelare la sospensione e trasferirla in una cuvetta per elettroporazione pre-raffreddata, con interasse tra gli elettrodi di 2 mm.
10. Rimuovere l'umidità all'esterno della cuvetta con carta velina e posizionare la cuvetta nella camera del campione dell'elettroporatore. Impulso con una tensione di 2,5 kV, una capacità di 25 μF e una resistenza di 200 Ω.
11. Rimuovere la cuvetta e aggiungere 1 ml di LB medium. Quindi, trasferire le cellule in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml e incubare per 2 ore a 37 °C agitando a 200 giri/min.
12. Distribuire 10 μl, 50 μl e 100 μl di aliquote della coltura su piastre sterili di LB-agar integrate con ampicillina (a una concentrazione di 100 μg/ml) e incubare le piastre a 37 °C per una notte.
13. Confermare l'espressione della GFP (eccitazione a 485 nm, emissione a 520 nm) esaminando la piastra al microscopio a fluorescenza con un canale GFP standard e scegliere una singola colonia per inoculare 5 mL di LB. Incubare per una notte come descritto al punto 1.1. Mescolare 0,5 ml di coltura notturna con 0,5 ml di glicerolo al 50% in una provetta con tappo a vite da 2 ml e conservare a -80 °C.

2. Preparazione della coltura starter per l'inoculazione

1. Due giorni prima dello screening, prelevare il ceppo di P. aeruginosa (contenente il plasmide ^C pCdrA::gfp) da una piastra di -80 °C su una piastra LB-agar (integrata con ampicillina a una concentrazione di 100 μg/ml) diffondendo delicatamente i batteri sulla piastra utilizzando un circuito di inoculazione sterile. Incubare la piastra per una notte a 37 °C.
2. La sera prima dello screening, inoculare una singola colonia di P. aeruginosa dalla piastra in 10 ml di terreno LB (integrato con ampicillina a una concentrazione di 100 μg/ml) in una provetta e incubare la pre-coltura per una notte a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
3. Il giorno dello screening, preparare una sottocoltura dalla pre-coltura notturna diluendola prima con terreno LB fresco fino a un OD₆₀₀ di 1,0 e poi diluendo ulteriormente con il 5% di LB fino a un OD₆₀₀ di 0,04 (rapporto 1:25).
   Nota: il volume totale del terreno inoculato dipende dal numero di piastre da testare. Il 5% LB viene prodotto diluendo il 100% LB con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) alla concentrazione richiesta. È importante sottolineare che il mezzo (5% LB) consente l'attivazione costitutiva di pCdrA::gfp^C in P. aeruginosa.
4. Aggiungere una barra di agitazione magnetica sterile nel contenitore e mescolare la coltura a velocità minima su un agitatore magnetico per 30 minuti a temperatura ambiente, consentendo ai batteri di acclimatarsi al terreno prima di essere dispensati in piastre da 384 pozzetti.

3. Inoculazione e incubazione delle piastre da 384 pozzetti contenenti piccole molecole

Nota: la sterilità e buone tecniche asettiche sono fondamentali per i passaggi successivi.

1. Per preparare il controllo positivo (inibizione al 100%), aggiungere 20 μl di tobramicina solfato (25 mg/ml) a 10 ml (adeguati per un massimo di 12 piastre) della sottocoltura preparata al punto 2.3 e mescolare delicatamente. Pipettare 40 μl della coltura di controllo positivo nei pozzetti A23-P23 (Figura 1).
2. Per preparare il controllo negativo (inibizione dello 0%), aggiungere 30 μl di dimetilsolfossido (DMSO) a 10 ml (adeguati per un massimo di 12 piastre) della sottocoltura preparata al punto 2.3 e mescolare delicatamente. Pipettare 40 μl della coltura di controllo negativo nei pozzetti A24-P24 (Figura 1).
3. Per ciascuna delle piastre stampate con le piccole molecole, inoculare un volume di 40 μl delle colture notturne diluite (descritte nella fase 2.3) nei pozzetti A1-P22 (Figura 1).
   Nota: questo può essere ottenuto utilizzando un robot per la movimentazione dei liquidi. A causa delle proprietà eterogenee delle colture batteriche, è importante mantenere un'agitazione continua e moderata per mantenere i batteri distribuiti in modo coerente nel terreno durante l'erogazione. Per fare ciò, continua a mescolare magneticamente la coltura acclimatata dal passaggio 2.4 durante l'erogazione.
4. Sigillare le piastre con un coperchio permeabile all'aria e incubare per 6 ore a 37 °C.
   Nota: la tenuta permeabile all'aria è fondamentale per mantenere le condizioni invariate in tutti i 384 pozzetti e per aggirare il potenziale sviluppo di gradienti di ossigeno attraverso la piastra.

4. Misurazione della crescita (OD600) e del livello intracellulare di c-di-GMP (GFP)

1. Circa 30 minuti prima della misurazione spettrofotometrica, preriscaldare il lettore di piastre a 37 °C per evitare la formazione di condensa.
2. Rimuovere delicatamente la guarnizione del coperchio permeabile all'aria prima della lettura. Misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 600 nm con un'impostazione di 10 flash per pozzetto e un tempo di assestamento di 0,2 sec.
3. Prima di misurare la fluorescenza, effettuare una regolazione automatica del guadagno e della focale in base al pozzetto A24 (controllo negativo) e impostare il valore target del guadagno al 75% (Figura 1).
   1. Dal software di controllo del lettore di piastre, fare clic su avvia misurazione e fare clic sulla scheda ''Regolazione messa a fuoco e guadagno/ID targhe''.
   2. Selezionare ''Regolazione messa a fuoco'' e ''Canale A'' sulla destra della finestra.
   3. Selezionare ''Regolazione guadagno'' e ''Selezionato bene'', e digitare ''75'' come ''Valore target''. Infine, selezionare il pozzo A24 nel layout della piastra prima di fare clic su ''Avvia regolazione''. Una volta effettuata la regolazione, fare clic su ''Avvia misurazione''.
   4. Misurare la fluorescenza dal reporter GFP a un massimo di eccitazione/emissione di 485/520 nm con un'impostazione di 10 flash per pozzetto e un tempo di assestamento di 0,2 sec.
4. Raccogli i dati da tutte le lastre esaminate.
   NOTA: Le letture dei dati vengono salvate automaticamente come predefinite dal software di controllo del lettore di piastre.
   1. Visualizzare le letture facendo clic sull'icona "Marte" all'interno del software di controllo per aprire il pacchetto di analisi statistica.
   2. Recupera i dati facendo "doppio clic" sul numero della targa di interesse per accedere ai dati per l'analisi.

Risultati

Figura 1. Una mappa su piastra a 384 pozzetti utilizzata per il saggio di screening di piccole molecole. I composti della libreria (azzurro) sono aliquotati nei pozzetti A1-P22. Il "controllo positivo" (rosso), costituito da una concentrazion...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Brodo di lisogenia (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-1KG
Saccarosio	Sigma Aldrich	S0389-1KG
Brodo di lisogenesi con agar (Lennox)	Sigma Aldrich	L2897-1KG
Ampicillina sodica	Sigma Aldrich	Codice A0166-25G
Glicerolo	Sigma Aldrich	G5516-1L
Soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4	Tecnologie di vita	10010-056
Solfato di tobramicina	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Spettrofotometro UV-Vis Genesys 10S	Termoscientifico	840-208100
cuvetta per elettroporatore con gap di 2 mm	Bio-Rad	1652092
Elettroporatore BioRad GenePulser XCell	Bio-Rad	1652662
Stereomicroscopio fluorescente Leica	Leica Microsystems	MZ16FA
Barra di agitazione magnetica BRAND, PTFE, cilindrica con anello girevole (sterilizzare in autoclave prima dell'uso)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
Piastre a 384 pozzetti, pareti bianche, fondo trasparente	Greiner	781098
Dispenser di reagenti Multidrop Combi	Termo Scientifico	5840300
Tubi Multidrop Combi	Termo Scientifico	24073290
Pipetta elettronica a 16 canali VIAFLO II	Integra Biosciences	4642
Serbatoi di reagenti sterili monouso da 100 ml	Fisher Scientifico	12399175
Membrane permeabili all'aria AeraSeal	Sigma Aldrich	MKBQ1886
Lettore di piastre Pherastar (versione software: 4.00 R4, versione firmware: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS