Screening di modulatori di-GMP ciclici utilizzando batteri che esprimono una proteina reporter fluorescente

Abstract

Fonte: Rugjee, K. N., et al. Istituzione di una configurazione ad alto rendimento per lo screening di piccole molecole che modulano la segnalazione c-di-GMP in Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra lo screening di modulatori di-GMP ciclici utilizzando batteri geneticamente modificati che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di un promotore sensibile al c-di-GMP. La fluorescenza viene misurata in una piastra a più pozzetti contenente diversi composti di prova. I composti che inibiscono la produzione di c-di-GMP portano a una riduzione della fluorescenza. I dati vengono quindi analizzati per identificare potenziali modulatori della segnalazione c-di-GMP nei batteri.

Protocol

1. Generazione di proteina fluorescente verde (GFP) etichettata come di-GMP ciclico (c-di-GMP) Ceppo Pseudomonas aeruginosa

1. Inoculare 5 ml di terreno di brodo lisogenico (LB) con una singola colonia di P. aeruginosa e incubare per una notte a 37 °C agitando a 200 giri/min.
2. Trasferire 2 ml di coltura notturna in 200 ml di terreno LB fresco in un pallone da 1 L e incubare a 37 °C agitando a 200 giri/min.
3. Monitorare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) ogni 30 minuti prelevando un campione da 1 ml dal pallone ed esaminandolo con uno spettrofotometro.
4. Quando l'OD₆₀₀ raggiun....

Results

Figura 1. Una mappa su piastra a 384 pozzetti utilizzata per il saggio di screening di piccole molecole. I composti della libreria (azzurro) sono aliquotati nei pozzetti A1-P22. Il "controllo positivo" (rosso), costituito da una concentrazion.......

Materials