Una tecnica per preparare una coltura batterica monoclonale

Abstract

Fonte: Lin, P., et al. Sintesi di microcapsule di tungstato di sodio e molibdato di sodio tramite escrezione minerale batterica. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra la preparazione di una coltura batterica monoclonale per la produzione di minerali attraverso la diluizione seriale e l'isolamento delle colonie su una piastra di agar. Agitando la piastra con perle di vetro, le singole cellule vengono separate spazialmente per formare colonie geneticamente uniformi, che vengono poi trasferite in mezzi liquidi per la crescita. Viene selezionata la coltura con la torbidità più elevata, che indica la popolazione monoclonale più densa e il maggior potenziale di produzione mineraria.

Protocollo

1. Preparazione delle perle di vetro

1. Mettere 100 perle di vetro di 3 mm di diametro in un flacone da laboratorio da 100 ml, quindi tappare ermeticamente.
2. Autoclavare il contenuto a 120 °C per 10 min.
3. Lasciare raffreddare il flacone a temperatura ambiente, quindi riporlo nella cabina di biosicurezza.

2. Preparazione del brodo di lisogenesi (LB)

1. Sciogliere 8 g di polvere di brodo LB-Lennox in un flacone da laboratorio da 500 ml con 400 ml di acqua.
2. Mescolare il contenuto con una barra di agitazione magnetica in politetrafluoroetilene (PTFE) per 20 minuti, quindi tapparlo ermeticamente.
3. Autoclavare il contenuto a 120 °C per 10 min.
4. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e posizionarla nella cabina di biosicurezza.
5. Utilizzando una pipetta, aliquotare il brodo in otto provette da centrifuga da 15 ml (12,5 ml ciascuna) nella camera di biosicurezza.
6. Aliquotare il brodo rimanente in tre flaconi da laboratorio da 100 ml nella cabina di biosicurezza (100 ml ciascuno). Tappare bene le tre bottiglie. Conservali nell'armadio di biosicurezza.

3. Coltura dell'alga Shewanella

1. Utilizzare il ceppo crioconservato surgelato.
2. Nella cappa di biosicurezza, prelevare 1 mL di materiale congelato dalla provetta congelata con una spatola di acciaio inossidabile e metterlo in una provetta da centrifuga preparata al punto 3.5.
3. Incubare le colture per 24 ore in un'incubatrice a 37 °C.

4. Preparazione delle piastre di Petri LB-Lennox (brodo con agar)

1. Sciogliere due compresse di LB-Lennox (brodo con agar) in un flacone da laboratorio da 100 ml con 100 ml di acqua.
2. Mescolare il contenuto con un'ancoretta magnetica in PTFE per 20 minuti e poi tapparlo ermeticamente.
3. Autoclavare il contenuto a 120 °C per 10 min.
4. Nella cabina di biosicurezza, aliquotare a mano 100 mL di soluzione in 4 piastre di Petri, assicurandosi che ciascuna riceva ~25 mL. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.

5. Preparazione di batteri monoclonali

1. Nella cabina di biosicurezza, etichettare i tre flaconi preparati rispettivamente nei passaggi 2.6, #1, #2 e #3.
2. Pipettare 0,1 mL della sospensione batterica risultante nella fase 3.3 nel flacone #1. Tappare la bottiglia e farla oscillare a mano per 1 minuto per ottenere una soluzione omogenea.
3. Pipettare 0,1 mL del liquido batterico risultante nel passaggio 5.2 nel flacone #2. Tappare la bottiglia e farla oscillare a mano per 1 minuto per ottenere una soluzione omogenea.
4. Pipettare 0,1 mL del liquido batterico risultante nel passaggio 5.3 nel flacone #3. Tappare il flacone e agitarlo a mano per 1 minuto per ottenere una soluzione omogenea.
5. Pipettare il liquido nel flacone #3 nelle 4 piastre di Petri preparate al punto 4.4, utilizzando un volume di 0,02 ml ciascuna.
6. Mettere le perle di vetro preparate al punto 1.3 nelle 4 piastre di Petri utilizzate, 4 perle in ogni piatto.
7. Chiudere i coperchi delle piastre di Petri e scuoterle a mano per 1 minuto.
8. Capovolgere le piastre di Petri e incubare in un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.

6. Moltiplicazione dei batteri monoclonali

1. Recupera 7 tubi preparati al punto 2.5.
2. Prelevare i batteri monoclonali risultanti dalle 4 piastre di Petri preparate al punto 5.8 con una spatola in acciaio inossidabile e metterli in 7 provette separatamente.
3. Lasciare le 7 provette in un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
4. Scegli quello con la maggiore dispersione della luce utilizzando il metodo colorimetrico visivo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
LB (brodo Lennox) con compresse di agar	Sigma-Aldrich	L7075	1 compressa per 50 ml di brodo con agar
LB (brodo Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) polvere 1 kg
Destrosio anidro	Reagente Nihon Shiyaku	PL 78695	glucosio
Provetta da 50 mL per centrifudge	Falcone	14-432-22
Provetta da 15 mL di centrifudge	Falcone	14-959-53A
Flacone da laboratorio 100 mL	Duran	21 801 24 5
Flacone da laboratorio 500 mL	Duran	21 801 44 5
Spatola in acciaio inox	Vetro chimico	CG-1981-10
Ancorette monouso in PTFE	Pescatore	S68066
Piastre di Petri in plastica	Pescatore	S33580A
Incubatrice	Fatto dal cliente	su misura	Riscaldare a 40 °C o raffreddare a 18 °C con Time Cotrol.
Armadio di biosicurezza	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Tutti i processi relativi ai batteri vengono eseguiti qui
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC	TM-329	riscaldare a 120 °C per 10 min