Sintesi di microcapsule di ossido di metallo utilizzando batteri metallo-riduttori

Abstract

Fonte: Lin, P., et al. Sintesi di microcapsule di tungstato di sodio e molibdato di sodio tramite escrezione minerale batterica. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra la procedura per la sintesi di microcapsule rigide di ossido di metallo mediante coltura di batteri che riducono i metalli con ioni metallici, seguita da una purificazione sequenziale attraverso sonicazione, centrifugazione e lavaggio con etanolo.

Protocollo

ATTENZIONE: Utilizzare guanti in lattice, occhiali protettivi e un camice da laboratorio per eseguire l'esperimento. Ogni volta che si utilizza la cabina di biosicurezza, accendere la ventola dell'armadio e tenere la porta dell'armadio semichiusa.

1. Preparazione delle perle di vetro

1. Mettere 100 perle di vetro di 3 mm di diametro in un flacone da laboratorio da 100 ml, quindi tappare ermeticamente.
2. Autoclavare il contenuto a 120 °C per 10 min.
3. Lasciare raffreddare il flacone a temperatura ambiente, quindi riporlo nella cabina di biosicurezza.

2. Preparazione del brodo di lisogenesi (LB)

1. Sciogliere 8 g di polvere di brodo LB-Lennox in un flacone da laboratorio da 500 ml con 400 ml di acqua.
2. Mescolare il contenuto con una barra di agitazione magnetica in PTFE (politetrafluoroetilene) per 20 minuti, quindi tapparlo ermeticamente.
3. Autoclavare il contenuto a 120 °C per 10 min.
4. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e posizionarla nella cabina di biosicurezza.
5. Utilizzando una pipetta, aliquotare il brodo in otto provette da centrifuga da 15 ml (12,5 ml ciascuna) nella camera di biosicurezza.
6. Aliquotare il brodo rimanente in tre flaconi da laboratorio da 100 ml (100 ml ciascuno) nella camera di biosicurezza. Tappare bene i tre flaconi e conservarli nella cabina di biosicurezza.

3. Coltura dell'alga Shewanella

1. Utilizzare il ceppo crioconservato surgelato.
2. Nella cappa di biosicurezza, prelevare 1 mL di materiale congelato dalla provetta congelata con una spatola di acciaio inossidabile e metterlo in una provetta da centrifuga preparata al punto 3.5.
3. Incubare le colture per 24 ore in un'incubatrice a 37 °C.

4. Preparazione delle piastre di Petri LB-Lennox (brodo con agar)

1. Sciogliere due compresse di LB-Lennox (brodo con agar) in un flacone da laboratorio da 100 ml con 100 ml di acqua.
2. Mescolare il contenuto con un'ancoretta magnetica in PTFE per 20 minuti e poi tapparlo ermeticamente.
3. Autoclavare il contenuto a 120 °C per 10 min.
4. Nella cabina di biosicurezza, aliquotare a mano 100 mL di soluzione in 4 piastre di Petri, assicurandosi che ciascuna riceva ~25 mL. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente.

5. Preparazione di batteri monoclonali

1. Nella cabina di biosicurezza, etichettare i tre flaconi preparati rispettivamente nei passaggi 2.6, #1, #2 e #3.
2. Pipettare 0,1 mL della sospensione batterica risultante nella fase 3.3 nel flacone #1. Tappare la bottiglia e farla oscillare a mano per 1 minuto per ottenere una soluzione omogenea.
3. Pipettare 0,1 mL del liquido batterico risultante nel passaggio 5.2 nel flacone #2. Tappare la bottiglia e farla oscillare a mano per 1 minuto per ottenere una soluzione omogenea.
4. Pipettare 0,1 mL del liquido batterico risultante nel passaggio 5.3 nel flacone #3. Tappare il flacone e agitarlo a mano per 1 minuto per ottenere una soluzione omogenea.
5. Pipettare il liquido nel flacone #3 nelle 4 piastre di Petri preparate al punto 4.4, utilizzando un volume di 0,02 ml ciascuna.
6. Mettere le perle di vetro preparate al punto 1.3 nelle 4 piastre di Petri utilizzate, 4 perle in ogni piatto.
7. Chiudere i coperchi delle piastre di Petri e scuoterle a mano per 1 minuto.
8. Capovolgere le piastre di Petri e incubare in un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.

6. Moltiplicazione dei batteri monoclonali

1. Recupera 7 tubi preparati al punto 2.5.
2. Prelevare i batteri monoclonali risultanti dalle 4 piastre di Petri preparate al punto 5.8 con una spatola in acciaio inossidabile e metterli in 7 provette separatamente.
3. Lasciare le 7 provette in un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
4. Scegli quello con la maggiore dispersione della luce utilizzando il metodo colorimetrico visivo.

7. Preparazione del brodo LB-Lennox con glucosio e sale

1. Metti 10 g di brodo LB-Lennox, 10 g di NaCl e 10 g di glucosio in un flacone da laboratorio da 500 ml. Aggiungere acqua fino a quando il volume raggiunge i 450 ml.
2. Mescolare il contenuto con un'ancoretta magnetica in PTFE per 20 minuti.
3. Autoclavare il contenuto a 120 °C per 10 min.

8. Preparazione del tungstato di sodio

1. Mettere 16,5 g di Sodium Tungstate Na₂WO 4.2H ₂O in un flacone da laboratorio da 100 ml con una spatola in acciaio inossidabile. Aggiungere acqua fino a quando il volume raggiunge i 50 ml.
2. Mescolare il contenuto con un'ancoretta magnetica in PTFE per 20 minuti.
3. Autoclavare il contenuto a 120 °C per 10 min.
4. Nella cabina di biosicurezza, ottenere il filtrato attraverso un filtro sottovuoto in fibra di vetro con pori di 1 μm.

9. Preparazione di LB con glucosio, sale e tungstato di sodio

1. Nella cabina di biosicurezza, versare a mano il filtrato acquisito al punto 8.4 nella soluzione con glucosio e sale preparata al punto 7.3.
2. Nella camera di biosicurezza, aliquotare con una pipetta i 500 mL della soluzione risultante al passaggio 9.1 in 10 provette da centrifuga da 50 mL.

10. Coltura dei batteri

1. Nella cabina di biosicurezza, prelevare il liquido preparato al punto 6.4 e aliquotarlo con una pipetta nelle 10 provette preparate al punto 9.2, ciascuna delle quali riceve 0,05 ml.
2. Incubare le 10 provette in un'incubatrice a 37 °C per 120 ore.

11. Raccolta di minerali BME

1. Ultrasuoni a ciascuno dei 10 tubi al passo 9.2 a 20 KHz con 150 W per 1 ora.
2. Centrifugare le provette a 2,025 x g per 1 ora.
3. Rimuovere il liquido limpido nelle provette con una pipetta, aggiungere acqua, quindi ripetere i passaggi 11.1 e 11.2 ancora una volta.
4. Rimuovere il liquido limpido nelle provette con una pipetta, aggiungere l'alcol e quindi ecosuonarle a 20 KHz con 150 W per 1 ora.
5. Centrifugare le provette a 2,025 x g per 1 ora.
6. Ripetere i passaggi 11.4 e 11.5 ancora una volta
7. Raccogliere i minerali BME rimuovendo il liquido limpido nelle provette con una pipetta; Successivamente, tappare immediatamente le provette senza eseguire alcun processo di asciugatura.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
LB(Lennox)brodo con compresse di agar	Sigma-Aldrich	L7075	1 compressa per 50 ml di brodo con agar
Brodo LB (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) polvere 1 kg
Destrosio anidro	Reagente Nihon Shiyaku	PL 78695	glucosio
Tungstato di sodio	Reagente Nihon Shiyaku	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Cloruro di sodio	Reagente Nihon Shiyaku	PL 68131	NaCl
Etanolo 99,5%	Acros organics	AC615090040	CH3CH2OH
Acqua	Prodotto nella nostra università		acqua deionizzata
Autoclave	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei City, Taiwan, ROC	TM-329	riscaldare a 120 °C per 10 min
Centrifuga	Sistema di laboratorio Digit System, nuova città di Taipei, Taiwan, ROC	DSC302SD	centrifuga a 2025 x g
-80 °C Frigorifero	Pananica	in MDF-U3386S	Utilizzare per congelare il ceppo crioconservabile
Omogeneizzatore ad ultrasuoni Sonicatore Processore Disgregatore cellulare	Lenox	gruppo di continuità UPS-150	frequenza 20 KHz potenza 150 W
Incubatrice	Fatto dal cliente	su misura	Riscaldare a 40 °C o raffreddare a 18 °C con Time Cotrol.
Bagni di agitazione reciproca	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
Piastra riscaldante con agitazione digitale	Corning	#6797-620D	utilizzo con ancoretta magnetica in PTFE
Armadio di biosicurezza	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Tutti i processi relativi ai batteri vengono eseguiti qui
Provetta da 50 mL per centrifudge	Falcone	14-432-22
Provetta da 15 mL di centrifudge	Falcone	14-959-53A
Flacone da laboratorio 100 mL	Duran	21 801 24 5
Flacone da laboratorio 500 mL	Duran	21 801 44 5
Spatola in acciaio inox	Vetro chimico	CG-1981-10
Ancorette monouso in PTFE	Pescatore	S68066
Piastre di Petri in plastica	Pescatore	S33580A
Alghe Shewanella	Per gentile concessione dell'autore #3	Per gentile concessione dell'autore #3