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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Progettazione sperimentale
- Iniziare il trattamento degli animali mediante gavagage orale, dopo 2 giorni di acclimatazione. Utilizzare una siringa con l'ago per sonda orale. Trattare 16 ratti con la sospensione di Bacillus subtilis BSB3 (1 ml per ratto) due volte al giorno per due giorni (gruppo B. subtilis). Trattare 16 ratti con soluzione salina tamponata con fosfato, PBS (1 ml per ratto), due volte al giorno per due giorni (gruppo PBS) (Figura 1).
- Dopo il trattamento, suddividere ogni gruppo (8 ratti per gruppo): Gruppo 1-controllo (PBS/senza stress), Gruppo 2-B. subtilis (B. subtilis /senza stress), Gruppo 3-stress (PBS/stress da calore) e Gruppo 4- B. subtilis + stress (B. subtilis/stress da calore).
- Misura la temperatura rettale di ogni ratto utilizzando un termometro digitale elettronico. Tenere i ratti dei gruppi 1 e 2 a temperatura ambiente per 25 minuti. Porre gli animali dei gruppi 3 e 4 in una camera climatica a 45 °C e 55% di umidità relativa per 25 min.
- Successivamente, misurare la temperatura rettale di ciascun ratto in tutti i gruppi utilizzando un termometro digitale elettronico. Mettere tutti gli animali a temperatura ambiente per 4 ore.
- Anestetizzare i ratti con isoflurano (2-4%) in un barattolo per anestesia sigillabile e osservare fino a quando i ratti non sono profondamente anestetizzati (assenza di risposta al pizzicamento delle dita). Eutanasia dei ratti mediante decapitazione rapida con ghigliottina.
- Raccogliere il sangue del tronco da ciascun ratto (15 - 16 ml) con le pipette apirogene in provette apirogene per ottenere il siero e prelevare immediatamente campioni di sangue (7 μl da ciascun ratto) con una pipetta per l'esame microscopico.
- Mettere le provette con il sangue in frigorifero per almeno 30 minuti per consentire la coagulazione. Centrifugare le provette a 20 °C, 7.000 x g per 10 minuti e rimuovere rapidamente il siero con una pipetta. Aliquotare il siero ottenuto da ciascun ratto in volumi di 50 μl e conservare a -20 °C fino al saggio.
2. Procedura chirurgica
- Tagliare/rifilare tutta la pelliccia dall'addome e dal torace della parte inferiore della carcassa con cesoie elettriche. Collocare la carcassa in un armadio sterile e trattare la superficie rasata della carcassa con alcol al 70%.
- Usa un bisturi sterile per creare un'incisione sulla linea mediana dell'addome. Rimuovere il fegato, i linfonodi mesenterici, la milza e l'intestino tenue da ciascun ratto utilizzando una pinzetta sterile.
3. Analisi della traslocazione batterica
- Posizionare ogni campione di fegato, linfonodi mesenterici e milza in provette sterili pre-pesate e pesare. Calcolare il peso del campione come la differenza tra il peso di una provetta con un campione e il peso di una provetta vuota.
- Aggiungere PBS sterile alla provetta per ottenere una diluizione 1:10 (peso per volume, p/v) del campione e omogeneizzare ogni campione con un omogeneizzatore di tessuto di vetro sterile per ottenere una sospensione omogenea.
- Effettuare diluizioni seriali (da 10-1 a 10-4) di ciascun campione in PBS sterile. Piastra 0,1 ml di tutte le diluizioni di ciascun tessuto sulla superficie di MacConkey e agar sanguigno al 5% e agar sanguigno Brucella con piastre di emina (0,005 g/L) e vitamina K1 (0,01 g/L).
- Incubare aerobicamente le piastre di agar sanguigno di MacConkey e le piastre di agar sanguigno di Brucella in condizioni anaerobiche a 37 oC.
- Contare le colonie di batteri aerobi dopo 24 ore e le colonie di batteri anaerobi dopo 48 ore di incubazione utilizzando un contatore di colonie. Esprimere i risultati come numero di unità formanti colonie (CFU) in un grammo di tessuto.
